Struktur, Katalyse, Chitintransport und selektive Hemmung der Chitinsynthase

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4776 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Chitin ist eines der am häufigsten vorkommenden natürlichen Biopolymere und dient als entscheidender Strukturbestandteil extrazellulärer Matrizen, einschließlich Pilzzellwänden und Insekten-Exoskeletten. Chitin ist ein lineares Polymer aus β-(1,4)-verknüpftem N-Acetylglucosamin und wird von Chitinsynthasen synthetisiert, die als Ziele für Antimykotika und Antiinsektenmedikamente gelten. In dieser Studie bestimmen wir sieben verschiedene kryoelektronenmikroskopische Strukturen einer Chitinsynthase aus Saccharomyces cerevisiae in Abwesenheit und Anwesenheit von Glykosyldonor-, -akzeptor-, -produkt- oder Peptidylnukleosid-Inhibitoren. In Kombination mit Funktionsanalysen zeigen diese Strukturen, wie die Donor- und Akzeptorsubstrate im aktiven Zentrum binden, wie die Substrathydrolyse die Selbstansaugung vorantreibt, wie sich ein Chitin-leitender Transmembrankanal öffnet und wie Peptidylnukleosid-Inhibitoren die Chitin-Synthase hemmen. Unsere Arbeit liefert eine strukturelle Grundlage für das Verständnis der Funktion und Hemmung der Chitin-Synthase.

Chitin ist nach Zellulose das zweithäufigste natürliche Polysaccharid auf der Erde, und jedes Jahr werden etwa 100 Milliarden Tonnen Chitin von lebenden Organismen produziert1. Chitin ist ein Hauptbestandteil der Zellwände von Pilzen, den Exoskeletten von Krebstieren und Insekten, und spielt eine wesentliche Rolle bei der Fortpflanzung, dem Wachstum oder der Entwicklung dieser Organismen2. Chitin ist ein langkettiges Polymer aus β-(1,4)-verknüpftem N-Acetylglucosamin (GlcNAc) und wird durch Chitin-Synthase in der Plasmamembran synthetisiert3,4. Chitin-Synthase katalysiert die Bildung von β(1 → 4)-glykosidischen Bindungen in Chitin unter Verwendung von UDP-aktiviertem GlcNAc (UDP-GlcNAc) als Zuckerdonor und transportiert währenddessen das Polysaccharidprodukt durch die Membran nach außen (Abb. 1a).

a Synthese- und Transportschema von Chitin durch Chs1. b In-vitro-UDP-Glo-Glykosyltransferase-Assay mit gereinigtem Chs1 in Puffer mit (WT) oder ohne (noGlcNAc) GlcNAc. Der Assay unter WT-Bedingungen wurde auch mit EDTA, Trypsin, NikkoZ oder PolyB durchgeführt. Als Kontrolle wurde die Reaktion ohne Chs1 verwendet. Die Datenpunkte stellen den Mittelwert ± SD in dreifacher Ausfertigung dar. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. c In-vitro-Chitinsynthesetest mit gereinigtem Chs1 in Puffer mit (WT) oder ohne (noGlcNAc) GlcNAc. Der Test unter WT-Bedingungen wurde auch mit EDTA und Trypsin durchgeführt. Als Kontrolle wurde die Reaktion ohne Chs1 verwendet. Die Datenpunkte stellen den Mittelwert ± SD in dreifacher Ausfertigung dar. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. d Kryo-EM-Karte und Atommodell des Apo-Chs1-Dimers. e Cartoon-Darstellung des Chs1-Monomers. Das Polypeptid ist vom N- bis zum C-Terminus in Regenbogenfarben dargestellt. Das mutmaßlich aktive Zentrum wird durch einen orangefarbenen Kreis hervorgehoben. Der mutmaßliche Chitin-Transportkanal ist durch einen violetten Pfeil umrandet. f Cartoon-Topologie des Chs1-Monomers. g Die Chs1-Domänenzuordnung. Hauptbereiche und Motive sind beschriftet. Der unsichtbare N-terminale Bereich ist weiß.

In Saccharomyces cerevisiae wird die Chitin-Synthase hauptsächlich durch CHS1, CHS2 oder CHS3 kodiert. Das gleichzeitige Ausschalten aller drei Gene ist bei Hefen tödlich5. ScChs1 und ScChs2 gehören zur gleichen Chitin-Synthase-Familie, die eine unterschiedliche Anzahl an Transmembranhelices von ScChs36 enthält. ScChs1 und ScChs2 sind für die Synthese des primären Septums verantwortlich und stehen im Zusammenhang mit der Zelltrennung bei der Zytokinese, während ScChs3 für die Bildung von Chitin im Knospenring und in der Zellwand verteiltem Chitin verantwortlich ist5,7,8,9,10,11. Frühere Studien zeigten, dass Chs1 hauptsächlich in einer Zymogenform vorliegt und durch Proteolyse aktiviert werden kann3,12,13.

Chitin-Synthase gehört zur Familie der GT-A-fach enthaltenden invertierenden Glykosyltransferasen 2, zu der auch Hyaluronan- und Cellulose-Synthasen gehören14,15. In den letzten Jahren wurden Strukturen von Hyaluronan- und Cellulosesynthasen beschrieben, die strukturelle Einblicke in ihre Wirkmechanismen liefern16,17,18,19,20,21. Die Struktur der Chitin-Synthase wurde jedoch nicht aufgeklärt, was ein mechanistisches Verständnis der katalytischen und Chitin-Transportmechanismen der Chitin-Synthase erschwert.

Da Chitin in Pflanzen und Wirbeltieren nicht verfügbar ist, gilt die Biosynthese von Chitin als attraktives Ziel für Fungizide, Insektizide, Akarizide und Antimykotika4,22. Beispielsweise ist Polyoxin B (PolyB) mit struktureller Ähnlichkeit zu UDP-GlcNAc ein kompetitiver Peptidylnukleosid-Inhibitor der Chitinsynthase und wird seit Jahrzehnten häufig als Antimykotikum gegen phytopathogene Pilze und Arthropodenschädlinge in der Land- und Forstwirtschaft eingesetzt23,24. Nikkomycin Z (NikkoZ), ein weiterer Peptidylnukleosid-Inhibitor der Chitin-Synthase, hat bei Säugetieren erhebliche klinische Vorteile gegen pathogene Pilze gezeigt25,26. Die Bestimmung der Strukturen der Chitin-Synthase im Komplex mit diesen Inhibitoren wird Einblicke in den Hemmmechanismus der Chitin-Synthase auf atomarer Ebene durch Peptidylnukleosid-Inhibitoren liefern und ist auch sehr hilfreich für die Entwicklung neuer Antimykotika.

In diesem Bericht haben wir sieben kryoelektronenmikroskopische (Kryo-EM) Strukturen von S. cerevisiae Chs1 im Apo-Zustand und im Komplex mit UDP-GlcNAc, UDP-GlcNAc+GlcNAc, UDP, UDP+GlcNAc, PolyB und NikkoZ bestimmt . Unsere Studien liefern molekulare Erkenntnisse darüber, wie Donor- und Akzeptorsubstrate im aktiven Zentrum binden, wie die Chitinsynthese initiiert wird, wie der Chitin-leitende Transmembrankanal funktioniert und wie Peptidylnukleosid-Inhibitoren die Chitin-Synthase hemmen.

Chs1 wurde in S. cerevisiae mit einem C-terminalen dreifachen FLAG-Tag überexprimiert und mit Anti-FLAG-Harzen gereinigt, gefolgt von Größenausschlusschromatographie (ergänzende Abbildung 1a, b). Zur Stabilisierung des Membranproteins wurden die Detergenzien Laurylmaltoseneopentylglykol (LMNG) und Cholesterylhydrogensuccinat (CHS) verwendet. Frühere Studien mit direkten Zelllysaten oder gereinigten Rohproben legten nahe, dass Chs1 in vitro inaktiv ist und durch Proteolyse aktiviert werden könnte3,12,13. Um diesen Vorschlag zu überprüfen, führten wir einen In-vitro-UDP-Glo-Glykosyltransferase-Assay und einen Chitin-Synthese-Assay unter Verwendung von gereinigtem Chs1 durch (Abb. 1b, c). Nach 60-minütiger Inkubation von gereinigtem Chs1 oder mit Trypsin verdautem Chs1 mit UDP-GlcNAc haben wir das freie UDP in der Reaktionslösung mit einem UDP-Glo-Kit gemessen oder das Chitinprodukt mit der WGA-gekoppelten Immun-HRP-Methode (Weizenkeim-Agglutinin) nachgewiesen27. WGA ist ein dimeres Lektin, das eine hohe Bindungsaffinität für GlcNAc-Reste oder -Oligomere aufweist. In Übereinstimmung mit früheren Studien zeigten die Ergebnisse beider Tests, dass die Aktivität von Chs1 durch Trypsin-Proteolyse um das etwa 1,5- bis 3-fache gesteigert wurde. Zu unserer Überraschung stellten wir auch eine geringe Aktivität für das gereinigte Chs1 allein fest (Abb. 1b, c), was durch einen zusätzlichen In-vitro-Chitinsynthesetest durch Anfärben von synthetisiertem Chitin mit Calcofluor White (CFW) weiter bestätigt wurde (ergänzende Abb. 2a). , B). CFW ist eine unspezifische Fluorochromfärbung für 1,3-β- und 1,4-β-verknüpfte Polysaccharide und zeigt Fluoreszenz, wenn es langwelligem Ultraviolett ausgesetzt wird28,29,30. Außerdem zeigte die UDP-GlcNAc-Hydrolyseaktivität von Chs1 in einem Puffer mit oder ohne EDTA, dass die Chs1-Aktivität Mg2+-abhängig ist (Abb. 1b, c).

Offenbar steht die Nachweisaktivität unseres gereinigten Chs1 im Widerspruch zu früheren Studien, dass Wildtyp-Chs1 inaktiv ist. Eine plausible Erklärung ist, dass die gereinigte Probe während der Reinigung durch endogene Protease verdaut und somit aktiviert wurde. Um diese Hypothese zu bestätigen, führten wir während der gesamten Reinigung eine erneute Reinigung von Chs1 mit überschüssigen Proteaseinhibitoren durch (ergänzende Abbildung 1a, c). Bemerkenswert ist, dass das neue gereinigte Chs1 eine Mischung aus zwei Proteinen ist, wie in der SDS-PAGE gezeigt. Die Anti-Flag-Western-Blot-Analyse ergab, dass beide Proteine ​​​​zu Chs1 gehören, während das größere Protein die gleiche Größe wie Wildtyp-Chs1 in der Membran hat (ergänzende Abbildung 1d). Weitere tryptische Verdauungsmassenspektrometrie für die beiden Proteine ​​​​zeigte, dass das größere Protein tatsächlich Wildtyp-Chs1 ist, während dem kleineren Protein etwa N-terminale 150 Reste von Chs1 fehlen (ergänzende Abbildung 1e, f). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass gereinigtes Chs1 im N-terminalen Bereich durch endogene Protease teilweise verdaut und somit teilweise aktiviert wurde.

Um zu verstehen, wie die Trypsin-Proteolyse Chs1 aktiviert, inkubierten wir gereinigtes Chs1 mit Trypsin in verschiedenen Massenverhältnissen und Zeiten und analysierten das Produkt mittels SDS-PAGE und Massenspektrometrie mit tryptischem Verdau (ergänzende Abbildung 3a – c). Wir haben gezeigt, dass die Proteolyse von gereinigtem Chs1 durch Trypsin ein Produkt mit einem Molekulargewicht von etwa 35–40 kDa unter dem des Wildtyp-Chs1 erzeugt (ergänzende Abbildung 3a, b), und dass die ersten etwa 340 Reste im N-Terminus von Chs1 wahrscheinlich durch Trypsin entfernt werden Behandlung (ergänzende Abbildung 3c). Um diesen Befund weiter zu bestätigen, haben wir ein verkürztes Chs1 exprimiert und gereinigt, indem wir 340 N-terminale Reste (Chs1-ΔN) gelöscht haben. Wir fanden heraus, dass Chs1-ΔN ungefähr die gleiche Größe hat wie das verdaute Produkt von gereinigtem Chs1 durch Trypsin (ergänzende Abbildung 3a) und nicht empfindlich gegenüber Trypsin-Proteolyse war wie frühere gereinigte Proben. Die Aktivität von Chs1-ΔN ähnelt auch der von Trypsin-behandeltem Wildtyp-Chs1 (ergänzende Abbildung 3d). Der Befund steht im Einklang mit unserer Kryo-EM-Struktur von Chs1, in der die ersten ca. 380 Reste von Chs1 weitgehend ungeordnet und daher empfindlicher gegenüber der Trypsin-Proteolyse sind (Abb. 1d – g). Dieser Befund steht auch im Einklang mit einer früheren Studie, wonach die Deletion der nicht homologen N-terminalen Region von Chs1 und Chs2 nur geringe Auswirkungen auf die Trypsin-aktivierte enzymatische Aktivität der entsprechenden Synthase hatte31. Insgesamt zeigten unsere Ergebnisse, dass die Proteolyseaktivierung des Chs1-Zymogens die Entfernung der N-terminalen Region (NTR) zum Ziel hat und die N-terminale Region des Chs1-Zymogens wahrscheinlich eine hemmende Funktion hat.

Wir führten eine Einzelpartikel-Kryo-EM-Analyse direkt an gereinigtem Chs1 und an Proben durch, die mit UDP-GlcNAc, UDP-GlcNAc+GlcNAc, UDP, PolyB und NikkoZ inkubiert wurden. Kryo-EM-2D-Mittelwerte zeigten, dass Chs1 eine dimere Architektur aufwies, die mit dem Elutionsvolumen bei der Gelfiltration übereinstimmte (ergänzende Abbildungen 1a, c, d). Schließlich haben wir acht Kryo-EM-3D-Karten von Chs1 in sieben verschiedenen Zuständen in einem Auflösungsbereich von 2,4 Å bis 3,6 Å erhalten (Ergänzende Abbildungen 4–10, Ergänzungstabelle 1).

Unter Verwendung der von AlphaFold2 vorhergesagten Struktur als Ausgangsmodell haben wir das Atommodell von Chs1 im Apo-Zustand in die Kryo-EM-Karte mit einer Auflösung von 2,6 Å eingebaut (Abb. 1d – f, ergänzende Abb. 5). Mit Ausnahme der N-terminalen Region und einiger kurzer Schleifen ist Chs1 größtenteils geordnet und gut aufgelöst (Abb. 1d – f, ergänzende Abb. 11). Wir haben auch Atommodelle für die sechs verbleibenden 3D-Karten von Chs1 erstellt, die eine etwas niedrigere Auflösung haben. Alle diese Modelle wurden auf gute Statistiken verfeinert (Ergänzungstabelle 1) und passen gut zu den 3D-Karten (Ergänzungsabbildung 12). Durch den Vergleich der 3D-Karten von Chs1 in den Zuständen Apo, UDP-GlcNAc-gebunden, UDP-GlcNAc+GlcNAc-gebunden, UDP-gebunden, UDP+GlcNAc-gebunden, PolyB-gebunden und NikkoZ-gebunden konnten wir entsprechende Substrate und Inhibitoren modellieren, die alle hatten deutliche Dichten im aktiven Zentrum (ergänzende Abbildung 13).

Hefe Chs1 hat 1131 Reste (Abb. 1g). Die Gesamtstruktur von Chs1 zeigt eine Dimerarchitektur mit zweifacher Symmetrie und ist etwa 100 Å hoch und 110 Å breit (Abb. 1d). Jedes Chs1-Monomer besteht aus einer großen zytosolischen löslichen Region und einer Transmembrandomäne (TMD), wobei sich sowohl der N-Terminus als auch der C-Terminus im Zytosol befinden. Mit Ausnahme einer kurzen Schleife von 245 bis 271 Resten sind die ersten 374 Reste von Chs1 weitgehend ungeordnet und in unseren Kryo-EM-Karten unsichtbar. Dem flexiblen N-Terminus folgt die Glycosyltransferase-Domäne (GTD), die sich in einer konservierten GT-A-Faltung mit einem 10-strängigen β-Faltblatt befindet, das von mehreren α-Helices und einigen β-Faltblättern umgeben ist. Im Chs1-Dimer interagieren die beiden GTDs nicht direkt und arbeiten wahrscheinlich unabhängig voneinander. Die Transmembrandomäne von Chs1 enthält 6 Transmembranhelices (TMHs) und ist durch ein geknicktes TMH1 gekennzeichnet (Abb. 1e, f). Die TMHs sind meist durch kurze Schleifen verbunden, mit Ausnahme einer zytosolischen Domänenaustauschschleife (T969 bis T1024) zwischen TMH4 und TMH5 und einer extrazellulären Schleife (EL3), die TMH5 und TMH6 verbindet. Bemerkenswert ist, dass sowohl die Austauschschleife als auch EL3 an der Bildung der Chs1-Dimer-Schnittstelle beteiligt sind (unten beschrieben). GTD interagiert mit der TMD hauptsächlich über drei amphipathische Schnittstellenhelices (IF1–3). Unter diesen liegen IF1 (P645 bis F668) und IF2 (V750 bis S780) proximal zu TMH1, während IF3 (Q934 bis N963) zwischen TMH4 und TMH5 eingefügt ist. Zwischen GTD und TMD befindet sich eine große Tasche, die der mutmaßlichen katalytischen Stelle entspricht. Darunter befindet sich eine große Innentasche im Transmembranbereich, die dem mutmaßlichen Chitin-Transportkanal entspricht (Abb. 1e).

Im Chs1-Dimer gibt es hauptsächlich drei Protein-Protein-Schnittstellen: die dichte Packung durch TMH2 und TMH5 beider Protomeren, die Wechselwirkung zwischen EL3 auf der Exoplasmaseite und TMH2' des benachbarten Protomers und die Wechselwirkung der Austauschschleife mit GTD' von das andere Protomer (Abb. 2a – c). Insbesondere interagieren TMH2 und TMH5 mit TMH2', hauptsächlich durch hydrophobe Wechselwirkungen, und bilden eine umgekehrte „V“-Form, die einen großen Hohlraum auf der Exoplasmaseite der Membran erzeugt (Abb. 2b). Interessanterweise fanden wir heraus, dass zwei Phospholipidmoleküle diesen Hohlraum vollständig ausfüllten und im Inneren durch EL3s versiegelt wurden. Die Acylketten der beiden Lipide sind alle gebogen und bilden umfangreiche hydrophobe Wechselwirkungen mit TMH2 und TMH5. Die Kopf- und Phosphatgruppen der Lipide gehen direkt Wasserstoffbrücken mit den Seitenketten von R871 in TMH5 und T1061 und D1066 in EL3 ein. Offensichtlich spielen Lipide eine strukturelle Rolle bei der Stabilisierung der Struktur des Chs1-Dimers. Die 56 Reste lange Austauschschleife von Chs1 trägt über ausgedehnte Kontakte mit GTD' des anderen Chs1-Protomers zur Dimerschnittstelle bei (Abb. 2c). Diese Schnittstelle ist durch viele hydrophobe Wechselwirkungen über L979, I982, V994, I1001, L1009, V1011, L1012 und zwei Tyrosine (Y1005 und Y1008) in der Austauschschleife gekennzeichnet. An der Schnittstelle sind auch zwei Polor-Reste (Q1002 und N1004) und das Segment 989–992 der Austauschschleife beteiligt. Bemerkenswerterweise bildet dieses Segment ein Beta-Faltblatt mit einem N-terminalen Segment 376–379 von GTD'. Die meisten dieser Rückstände sind konserviert (ergänzende Abbildung 14).

eine Cartoon-Darstellung des Chs1-Dimers. Die dimeren Grenzflächen werden durch schwarze und orangefarbene Rechtecke hervorgehoben. b Eine vergrößerte Ansicht der Grenzflächenregion im orangefarbenen Kasten in (a). Der Aufbau von Chs1 wird in einem Cartoon dargestellt. Wichtige Rückstände und zwei versiegelte Phospholipidmoleküle werden in Stäbchendarstellung dargestellt. c Eine vergrößerte Ansicht der Grenzflächenregion in der Blackbox in (a). Die Domain-Swapping-Schleife (SL) eines Protomers ist in einer Cartoon-Darstellung und das andere Protomer in einer Oberflächenelektrostatik dargestellt. Die hervorgehobenen SL-Reste in der Grenzfläche sind in Strichform dargestellt. d Gelfiltrationsprofil des verkürzten Chs1 (ΔSL) der Austauschschleife und des Wildtyp-Chs1 (WT). e In-vitro-UDP-Glo-Glykosyltransferase-Assay von Chs1-ΔSL. Die Datenpunkte stellen den Mittelwert ± SD in dreifacher Ausfertigung dar. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. f In-vitro-Chitinsynthesetest von Chs1-ΔSL. Die Datenpunkte stellen den Mittelwert ± SD in dreifacher Ausfertigung dar. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. g Wachstumskomplementation von Wildtyp-w303-Zellen (w303) und chs1Δ-Zellen mit leerem Plasmid (chs1Δ) oder Plasmid, das entweder Wildtyp-Chs1 (chs1Δ+Chs1) oder Chs1-ΔSL (chs1Δ+Chs1-ΔSL) trägt. Zellbilder wurden aufgenommen, als die Zellen auf OD = 1 wuchsen. Der Phänotyp des Zellstrangs ist ein Indikator dafür, wie stark die Funktion von Chs1 in vivo gestört ist. Es wurden drei unabhängige Experimente mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.

Die Dichten der Austauschschleife in unseren ermittelten Strukturen sind relativ schwächer als die in anderen Teilen von Chs1 oder sogar unsichtbar, was darauf hindeutet, dass sie nur teilweise stabilisiert ist (Abb. 1d, ergänzende Abbildungen 4–10, 15a, b). Es wird unter Verwendung der von Alphafold2 vorhergesagten Struktur als Ausgangsmodell erstellt. Eine solche Dynamik der Austauschschleife könnte für die Funktion von Chs1 relevant sein. Um die genaue Rolle der Austauschschleife zu untersuchen, exprimierten und reinigten wir ein verkürztes Chs1 (Chs1-ΔSL) der Austauschschleife in einem Chs1-Knockout-Stamm, wodurch die Bildung eines Heterodimers aus endogenem Wildtyp-Chs1 und Chs1-ΔSL vermieden wurde. Das Elutionsvolumen des Gelfiltrationspeaks und des nativen Gels zeigte, dass gereinigtes Chs1-ΔSL viel kleiner ist als Wildtyp-Chs1 (Abb. 2d, ergänzende Abb. 15c). Das SDS-PAGE-Gel von gereinigtem Chs1-ΔSL zeigte, dass die N-terminale Region während der Reinigung durch die Verarbeitung durch Trypsin weitgehend abgebaut wurde (ergänzende Abbildung 15d), was darauf hinweist, dass die N-terminale Hemmregion von Chs1-ΔSL empfindlicher gegenüber Proteolyse ist. Dieser Befund steht im Einklang mit unserer Kryo-EM-Karte von Chs1 im Apo-Zustand, die das Segment 989–992 der Austauschschleifenpakete auf den Segmenten 245–271 und 376–379 von NTR zeigte (Abb. 2c, ergänzende Abb. 15b). Es ist denkbar, dass die Entfernung der Austauschschleife die Interaktion völlig unterbricht und den NTR für die Proteolyse flexibler macht.

Wir führten außerdem Aktivitätstests für Chs1-ΔSL durch und stellten eine dramatisch erhöhte Aktivität von Chs1-ΔSL fest, die mehr als das Zehnfache der Aktivität unseres gereinigten Chs1 betrug (Abb. 2e, f, ergänzende Abb. 2a, b). Eine solch hohe Aktivität ist unerwartet, da die Trypsin-Proteolyse die Aktivität von Chs1 nur um das 1,5- bis 3-fache erhöht, wie oben erwähnt. Dies bedeutet, dass die erhöhte Aktivität durch die Deletion der Austauschschleife nicht nur durch die Proteolyse von NTR verursacht wird. Darüber hinaus ist es wahrscheinlich, dass die Austauschschleife direkt an der Einschränkung der Chs1-Aktivität beteiligt ist und den größten hemmenden Effekt auf die Chs1-Aktivität hat. Wenn ja, kann die Proteolyseaktivierung von Chs1 tatsächlich durch eine Verbesserung der Flexibilität der Austauschschleife erreicht werden.

Da Chs1-ΔSL in vitro hochaktiv war, fragen wir uns, ob Chs1-ΔSL die Funktion von dimerem Chs1 in vivo ersetzen kann oder nicht. Wir führten einen In-vivo-Wachstumskomplementationstest von Chs1-ΔSL unter Verwendung des Hefestamms Chs1Δ durch (Abb. 2g, ergänzende Abb. 15e, 15). Frühere Studien deuteten darauf hin, dass der Chs1Δ-Stamm aufgrund des gestörten Aufbaus des primären Septums, das Mutter- und Tochterzellen trennt, einen Zellstrang bildet. Wir fanden heraus, dass dieser Mangel durch ein Plasmid ergänzt werden kann, das das Wildtyp-Chs1-Gen trägt. Im Gegensatz dazu war Chs1-ΔSL nicht in der Lage, den chs1Δ-Hefephänotyp wie der Wildtyp-Chs1 vollständig wiederherzustellen, was darauf hindeutet, dass die Austauschschleife für die reguläre Zellfunktion von Chs1 wesentlich ist. Mögliche Gründe hierfür sind ein gestörter Dimerzustand oder eine übermäßige Aktivität von Chs1-ΔSL. Es ist auch möglich, dass die Deletion von SL die Lokalisierung von Chs1 in der Plasmamembran schädigt.

Außerdem stellen wir fest, dass die Austauschschleife mit einem konservierten WGTKG-Motiv beginnt (ergänzende Abbildung 15a) und dass sich die Mutation entsprechender Reste in Hefe-Chs2 als wesentlich für die Chitinsyntheseaktivität erwiesen hat . Wir fanden auch heraus, dass sowohl W969A als auch G970A nicht in der Lage waren, den chs1Δ-Hefephänotyp zu retten (ergänzende Abb. 15e, 15), was auf die wichtige Rolle des WGTKG-Motivs hinweist.

Die zytosolische GT-Domäne von Chs1 nimmt eine konservierte GT-A-Faltung an, wobei sich die mutmaßliche katalytische Stelle in der Tasche zwischen GTD und TMD befindet. Um den Zuckerdonor- und -akzeptor-Bindungsmechanismus zu verstehen, haben wir die Struktur von Chs1 im Komplex mit UDP-GlcNAc-Donor und GlcNAc-Akzeptor (UDP-GlcNAc + GlcNAc-gebundener Zustand) mit einer Auflösung von 2,9 Å bestimmt (Abb. 3a, ergänzende Abb. 6). ). Der Vergleich dieser Karte mit der Karte im Apo-Zustand ergab deutliche zusätzliche Dichten in der mutmaßlichen aktiven Tasche, die dem Zuckerdonor (UDP-GlcNAc), dem Akzeptor (GlcNAc) und Mg2+ entsprechen (ergänzende Abbildung 13). Obwohl wir Wildtyp-Chs1 verwendeten, wurde UDP-GlcNAc in unserer Struktur nicht hydrolysiert, wahrscheinlich aufgrund der niedrigen Inkubationstemperatur und der geringen Aktivität von Chs1.

a Nahaufnahme des aktiven Zentrums von Chs1 (grün) im Komplex mit UDP-GlcNAc-Donor, GlcNAc-Akzeptor (lila) und Mg2+ (Kalk). Wichtige Reste werden in Stäbchendarstellung dargestellt. b Strukturelle Ausrichtung von Chs1 in den Zuständen Apo, UDP-GlcNAc-gebunden, UDP-GlcNAc+GlcNAc-gebunden und UDP-gebunden. Der rote Pfeil markiert die Schaltschleife von Chs1, die sich von der Apo-Position in die umgedrehte Position bewegt. c Wachstumskomplementierung von Wildtyp-w303-Zellen (w303) und chs1Δ-Zellen mit leerem Plasmid (chs1Δ) oder Plasmid, das entweder Wildtyp-Chs1 (WT) oder Mutanten trägt. Repräsentative Zellbilder sind in der ergänzenden Abbildung 13 dargestellt. Die Zellfolge bezieht sich auf eine Folge nicht getrennter Zellen mit der Nummer ≥3. Für jeden dieser Stämme wurden >2000 Zellen gezählt und berechnet, wobei w303 und chs1Δ als negative und positive Kontrollen verwendet wurden. Der Phänotyp des Zellstrangs ist ein Indikator dafür, wie stark die Funktion von Chs1 in vivo gestört ist. d Strukturvergleich zwischen UDP-GlcNAc-Donor-gebundenem Chs1 (lila) und geprimtem UDP+GlcNAc-gebundenem Chs1 (cyan) durch Ausrichtung ihrer TMs. Der orangefarbene Pfeil markiert die Verschiebung der GT-Domäne und des Nukleotids in Richtung Membran vom Donor-gebundenen Zustand in den vorbereiteten Zustand. Die aktive Seite wird durch ein blaues Rechteck hervorgehoben. Der Zuckerspender wird durch ein gelbes Rechteck hervorgehoben. e Nahaufnahme des aktiven Zentrums von geprimtem Chs1 (Cyan) im Komplex mit UDP, GlcNAc und zwei Mg2+-Ionen (Kalk). Dies ist eine Vergrößerung des blauen Rechtecks ​​in (d) von links gesehen. Untergründe und Schlüsselreste werden in Stiftdarstellung dargestellt. f Vergrößerung des gelben Rechtecks ​​in (d) von hinten gesehen. Dargestellt sind UDP (Cyan) und Mg2+ (Kalk) des geprimten Chs1 sowie UDP-GlcNAc (lila) und Mg2+ (lila) des donorgebundenen Chs1. α- und β-Phosphate sind markiert, was eine 180°-Rotation des β-Phosphats von UDP-GlcNAc zu UDP hervorhebt.

In der Struktur wird die Nukleotidbasengruppe von UDP-GlcNAc durch T453, M454, Y455, E457 und K578 an der Spitze des aktiven Zentrums stabilisiert, indem eine π-π-Wechselwirkung mit Y455 und hydrophober Kontakt mit anderen Resten gebildet wird; das Phosphat von UDP-GlcNAc interagiert mit Q756 und R759 im konservierten QXXRW-Motiv und einem Mg2+; Die GlcNAc-Einheit von UDP-GlcNAc befindet sich direkt über IF2 in einer gebogenen Konfiguration, die sich vom aktiven Zentrum nach außen erstreckt. Am unteren Rand des aktiven Zentrums bilden Y654 in IF1, W760 in IF2, R718 und ein konserviertes VLPGA-Motiv (Reste 673–677) die GlcNAc-Akzeptorbindungsstelle (Abb. 3a, b). Der GlcNAc-Ring wird vertikal in einen Schlitz zwischen dem Indolring von W760 und dem Pyrrolidinring von P675 eingeführt und bildet drei parallele Ringe, die etwa 4 Å voneinander entfernt sind. Unterhalb des GlcNAc-Moleküls befindet sich eine Gruppe geladener Reste, die GlcNAc an der Bindungsstelle halten, wie z. B. E653, S657 und K662 von IF1. Es ist zu beachten, dass die Akzeptorbindungsstelle das Tor ist, das das aktive Zentrum mit dem Chitin-Transmembran-Transportkanal verbindet.

Überraschenderweise stellten wir fest, dass der Abstand zwischen der Hydroxygruppe in C4 des GlcNAc-Akzeptors und dem C1 der GlcNAc-Einheit von UDP-GlcNAc bis zu ~7 Å beträgt. Als mutmaßlicher katalytischer Basenrest interagiert D717 auch nicht mit UDP-GlcNAc in der Struktur. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die GlcNAc-Einheit von UDP-GlcNAc möglicherweise horizontal gedreht und in das aktive Zentrum eingefügt werden muss, um in der folgenden Reaktion eine glykosidische β(1-4)-Bindung zu bilden (Abb. 3a). Das UDP-GlcNAc in unserer Struktur befindet sich wahrscheinlich in einer Ladeposition und wandelt sich nach der Rotation in eine eingefügte Position zur Substrathydrolyse um. Übereinstimmend stellten wir fest, dass die GlcNAc-Gruppe von UDP-GlcNAc nicht spezifisch mit irgendeinem Rest interagiert und ihre Dichte etwas schwächer ist als die der UDP-Einheit, was darauf hindeutet, dass die GlcNAc-Gruppe eine gewisse Flexibilität behält (Abb. 3a, ergänzende Abb. 13). ). Darüber hinaus fanden wir heraus, dass Mg2+, das β-Phosphat stabilisiert, nur von E457, D602, T605 und D745 umgeben ist, aber nicht eng mit irgendeinem Rest in der Struktur koordiniert, da ihre Abstände alle >4 Å sind. Dies ist wahrscheinlich teilweise darauf zurückzuführen, dass das konservierte metallkoordinierte DxD-Motiv in anderen metallabhängigen GT-A-Falten-Glycosyltransferasen durch ein DAG-Motiv (Reste 602–604) in Chs1 ersetzt wird (Abb. 3a, ergänzende Abb. 14). Eine solche Architektur von Mg2+ ermöglicht die Bewegung von β-Phosphat.

Wir mutierten Schlüsselreste im oben identifizierten aktiven Zentrum und führten einen In-vivo-Wachstumskomplementationstest durch (Abb. 3c, ergänzende Abb. 16). Wir fanden heraus, dass die N456A/E457A-, D602A- und E752R-Mutanten der Donor-Bindungsstelle und die S657F/N658F-, K662M-, V673S-, L674Q-, P675L-, P675T-, G676L-, R718L- und W760A-Mutanten der Akzeptor-Bindungsstelle die Chs1-Funktion erheblich störten. da sie nicht in der Lage waren, den Chs1Δ-Hefephänotyp zu retten. Darüber hinaus beeinträchtigten K578A, D745R, Q756L und R759A die Chs1-Funktion mäßig, was darauf hindeutet, dass sie weniger wichtig sind.

Die strukturelle Ausrichtung zwischen Chs1 im Apo- und UDP-GlcNAc + GlcNAc-gebundenen Zustand ergab, dass die meisten Reste im aktiven Zentrum mit Ausnahme der konservierten VLPGA-Schleife nahezu identisch sind (ergänzende Abbildung 17a). Im Apo-Zustand wird der Weg vom aktiven Zentrum zum Chitin-Transmembrankanal durch die VLPGA-Schleife blockiert, in der der Prolinring von P675 durch Packung mit dem Indolring von W760 stabilisiert wird (Abb. 1e, 3b). Im Gegensatz dazu verschob sich diese Schleife im UDP-GlcNAc+GlcNAc-gebundenen Zustand um 3–5 Å weg, was zu einem kontinuierlichen Chitin-Verlängerungspfad vom aktiven Zentrum zur Innentasche von Chs1 führte (Abb. 3b, 4a–d). Die Bewegung der Schleife vom Apo- in den UDP-GlcNAc + GlcNAc-gebundenen Zustand ähnelt eher einem Umdrehen, da die Seitenketten von V673, L674 und P675 alle um fast 180 ° umgedreht sind (ergänzende Abbildung 17b). Wie oben erwähnt, zeigte der Wachstumskomplementationstest der P675L-, P675T- und G676L-Mutanten ihre wesentliche Rolle bei der Chs1-Funktion (Abb. 3c). Es ist denkbar, dass das Umdrehen der Schleife einer der Hauptschritte bei der Initiierung der Chitinsynthese durch Chs1 ist. Interessanterweise verfügt die Hyaluronan-Synthase (HAS) über eine Schaltschleife (CVGGP) in ähnlicher Position, die sich jedoch während der Katalyse nur geringfügig nach oben und unten verschiebt und nicht wie die Schleife in Chs1 als Tor fungiert (ergänzende Abbildung 18c, d)16. Daher haben wir die Schleife von Chs1 auch „Schalterschleife“ genannt, die den Chitintransportweg im Apo-Zustand schließt und während der Chitinsynthese öffnet (Abb. 4b – d).

eine Schnittansicht von Chs1 (grün) im Komplex mit UDP-GlcNAc (orange), GlcNAc (lila) und Mg2+ (Kalk). Chs1 werden in Cartoon- und elektrostatischer Oberfläche dargestellt. Zwei rote Pfeile markieren den Weg des Chitin-Transportkanals. Chitin-Transportkanal von Chs1 im UDP-GlcNAc+GlcNAc-gebundenen Zustand (b) und Apo-Zustand (c). Der Kanal wurde vom Programm HOLE berechnet und durch blaue Punkte dargestellt. Das zytosolische Tor und das exoplasmatische hydrophobe Tor sind durch rote Pfeile hervorgehoben. d Die Porengrößen des Chitin-Transportwegs in (b) und (c) sind dargestellt. e Mutmaßlicher Transmembran-Chitin-Transportkanal von Chs1 mit Resten, die den Kanal auskleiden, dargestellt als Stäbchen. Markierungen polarer Rückstände werden blau hervorgehoben. Markierungen von Resten, die das exoplasmatische hydrophobe Tor bilden, werden durch einen gelben Hintergrund hervorgehoben. f, g Zwei Extreme der 3DVA-Analyse der spendergebundenen Chs1-Struktur. Die Domänenaustauschschleife, TMH4 und der exoplasmatische Ausgang sind in zwei Karten markiert.

Die Initiierung der Chitinsynthese erfordert die Bindung des GlcNAc-Akzeptors im aktiven Zentrum von Chs1. Um den Mechanismus der Chitin-Synthase zu verstehen, ist es wichtig aufzudecken, wie das erste GlcNAc erzeugt wird. Aufgrund des Fehlens einer freien GlcNAc-Quelle in vivo deuten frühere Studien darauf hin, dass sich Chitinsynthasen „selbst vorbereiten“ können, indem sie GlcNAc aus UDP-GlcNAc mit einer intrinsischen UDP-GlcNAc-Hydrolyseaktivität erzeugen34,35. Wir stellten übereinstimmend fest, dass Chs1 im Puffer ohne GlcNAc aktiv war (Abb. 1b, c). Um den Selbstansaugmechanismus von Chs1 aufzudecken, führten wir eine zeitabhängige Kryo-EM-Analyse von Chs1 durch, das mit UDP-GlcNAc-Donor für 5 Minuten und 40 Minuten inkubiert wurde, und ermittelten zwei Kryo-EM-Karten von Chs1 mit einer Auflösung von 3,1 Å (UDP- GlcNAc-10min und UDP-GlcNAc-40min) (Ergänzende Abbildungen 5, 6). Anhand der Dichten der Substrate haben wir festgestellt, dass sich die UDP-GlcNAc-5-Minuten-Struktur in einem Zustand befindet, in dem sich UDP-GlcNAc in der Ladeposition befindet (UDP-GlcNAc-Ladezustand), während sich die UDP-GlcNAc-40-Minuten-Struktur in der Ladeposition befindet der UDP+GlcNAc-gebundene Zustand (geprimter Zustand) (ergänzende Abbildung 13). Dies weist darauf hin, dass Chs1 in der letztgenannten Struktur einen vollständig hydrolysierten UDP-GlcNAc-Donor aufweist und selbstprimiert war.

In der UDP-GlcNAc-Ladestruktur befindet sich die Schaltschleife in der Apo-Position, was darauf hinweist, dass die UDP-GlcNAc-Bindung die Schaltschleife nicht aktiviert (Abb. 3b, d). In der vorbereiteten Chs1-Struktur befindet sich die Schaltschleife in der umgedrehten Position und GlcNAc ist zwischen P675 und W760 eingeschlossen (Abb. 3d, e). Das C3-Hydroxyl von GlcNAc bildet eine Wasserstoffbrücke mit R718, wodurch das C4-Hydroxyl von GlcNAc in Richtung der Donorbindungsstelle positioniert wird (Abb. 3e). Darüber hinaus stellten wir fest, dass die UDP-GlcNAc-Hydrolyse eine Starrkörperbewegung der GT-Domäne in Richtung der Membran um etwa 1,5–2,5 Å induziert, was dazu beitragen kann, das Produkt in den Kanal zu drücken (Abb. 3d). Ähnlich wie bei der GT-Domäne bewegt sich auch das gebundene UDP in Richtung Membran und bildet eine neue einzigartige Konfiguration. Die β-Phosphatgruppe von UDP drehte sich vom UDP-GlcNAc-Beladungszustand in den vorbereiteten Zustand um nahezu 180 ° in Richtung der Akzeptorbindungsstelle (Abb. 3f). Das rotierte β-Phosphat wird hauptsächlich durch Q756 und R759 stabilisiert (Abb. 3d). Bemerkenswerterweise wurden zwei Mg2+-Ionen identifiziert, die das α-Phosphat durch enge Koordination mit E457 und D745 in der geprimten Chs1-Struktur stabilisieren, was sich von der relativ lockeren Bindung von Mg2+ im UDP-GlcNAc-Beladungszustand unterscheidet (Abb. 3d, e). . Diese Ergebnisse stützen unseren früheren Vorschlag, dass die GlcNAc-Einheit von UDP-GlcNAc zur Bildung von β(1 → 4)-glykosidischen Bindungen in eine eingefügte Position gedreht werden muss.

Um zu bestätigen, welches Produkt der UDP-GlcNAc-Hydrolyse das Umdrehen der Schaltschleife induziert, haben wir außerdem zwei Kryo-EM-Karten von Chs1 bestimmt, das mit GlcNAc oder UDP mit einer Auflösung von 3, 5 Å bzw. 3, 6 Å inkubiert wurde (ergänzende Abbildung 9). Wir fanden heraus, dass sich die erste Struktur noch im Apo-Zustand ohne GlcNAc-Bindung befand, was darauf hindeutet, dass GlcNAc allein die Schaltschleife nicht aktivieren konnte (ergänzende Abbildung 13). Im Gegensatz dazu wurde die Schaltschleife allein durch das UDP-Produkt aktiviert, wie in der UDP-gebundenen Chs1-Struktur gezeigt (Abb. 3b). Das UDP befindet sich ebenfalls in einer umgedrehten Konfiguration, ähnlich wie UDP im vorbereiteten Zustand. Insgesamt deuten die Ergebnisse auf den Prozess der UDP-GlcNAc-Hydrolyse zu UDP hin, und die Rekonfiguration von UDP induziert das Umlegen der Schaltschleife und die Öffnung des Pfades vom aktiven Zentrum zum Transmembrankanal.

Der mutmaßliche Transmembran-Chitin-Transportkanal von Chs1 besteht hauptsächlich aus TMH1, TMH3-4 und TMH6 und befindet sich direkt unter dem aktiven Zentrum (Abb. 4a, e). Diese TMHs bilden einen trichterförmigen Hohlraum in der Membran, der aus einem hydrophilen oberen Teil und einem hydrophoben unteren Teil besteht (Abb. 4a, e). Im oberen Teil des Hohlraums befinden sich zahlreiche polare Reste, darunter E653, S657 und D661 von IF1; N801, S805 und S808 von TMH1; Y925, Y945 und S949 von IF3; und S1108 und R1112 von TMH6. Die hydrophile Umgebung begünstigt die Chitinverlängerung und den Chitintransport. Im Gegensatz dazu besteht der untere Teil des Hohlraums hauptsächlich aus hydrophoben Rückständen (Abb. 4e). Unter ihnen bilden L819 von TMH1, M886 von TMH3, F911, I914, L918 von TMH4 und F1098 von TMH6 ein geschlossenes hydrophobes Tor, das den Hohlraum daran hindert, sich mit der Exoplasmaseite zu verbinden. Möglicherweise muss das untere hydrophobe Tor während der Chitinsynthese geöffnet werden. Zwei polare Reste in der Nähe des hydrophoben Gates, S883 und S917, scheinen bei diesem Prozess ebenfalls eine wichtige Rolle zu spielen, wie im In-vivo-Wachstumskomplementationstest der Doppelmutante S883F/S917F gezeigt (Abb. 3c).

Das exoplasmatische Ende von TMH4 und die angrenzende Schleife, die TMH3 und TMH4 verbindet, erweisen sich als äußerst flexibel, was durch ihre schwachen Dichten in allen unseren Kryo-EM-Karten angezeigt wird. Dies legt nahe, dass TMH4 beweglich ist und die Dynamik wahrscheinlich mit der hydrophoben Toröffnung von Chs1 während der Chitinsynthese korrespondiert. Um diese Hypothese weiter zu bestätigen, führten wir eine 3D-Variabilitätsanalyse (3DVA) der Chs1-Struktur im UDP-GlcNAc-Beladungszustand durch. 3DVA ist eine in cryoSPARC neu entwickelte Software zur Darstellung der kontinuierlichen Variabilität und diskreten Heterogenität einer Struktur36. Wir fanden heraus, dass sich TMH4 in zwei Extremen von wohlgeordnet zu ungeordnet verändert und dementsprechend der Chitin-Transportkanal geschlossen und geöffnet wird (Abb. 4f, g, Zusatzfilm 1). Dies bestätigte die Flexibilität von TMH4 in der Karte. Wir beobachteten auch, dass die Dichte der Domänenaustauschschleife gleichzeitig mit der Unordnung der TMH4-Dichte ungeordnet wurde. In diesem Zustand verfügt Chs1 über einen geöffneten Chitin-Translokationskanal und keine in GTD gebundene Domänenaustauschschleife (Abb. 4g). Dies könnte darauf hindeuten, dass die Öffnung des Translokationskanals mit der Freisetzung einer inhibitorischen Austauschschleife aus der GTD-Domäne korreliert.

Der Hohlraum hat eine seitliche Öffnung in der Mitte der Lipiddoppelschicht, die von TMH3, TMH4 und IF3 gebildet wurde (Ergänzende Abbildung 19). Darüber hinaus wurden zwei horizontale längliche Dichten beobachtet, die den Hohlraum von der seitlichen Öffnung aus füllten, und die Dichten ähnelten in ihrer Form zwei Sterolmolekülen. Es ist unklar, ob Sterolmoleküle in vivo verfügbar sind oder während der Reinigung eingeführt werden, aber sie müssen während des Chitintransports eindeutig aus der Höhle diffundieren. Ähnliche Lipide wurden auch in der Struktur der Hyaluronan-Synthase gefunden16.

Polyoxine und Nikkomycine sind beide natürliche Peptidylnukleosid-Antibiotika. Mit struktureller Ähnlichkeit zu UDP-GlcNAc zeigen PolyB und NikkoZ, zwei Hauptkomponenten von Peptidylnukleosid-Inhibitoren, eine antimykotische und insektenhemmende Wirkung, indem sie als kompetitive Inhibitoren der Chitin-Synthase wirken. Die Nukleosideinheiten von PolyB und NikkoZ sind die gleichen 5-Aminohexuronsäuren, die N-glykosidisch an Uracil gebunden sind. Im Gegensatz dazu enthalten die Peptidyleinheiten von PolyB Carbamoylpolyoxamsäure und NikkoZ enthält Hydroxypyridylhomothreonin. Wir führten den In-vitro-UDP-Glo-Glykosyltransferase-Assay mit PolyB oder NikkoZ im Reaktionspuffer durch und stellten fest, dass die Chs1-Aktivität um mehr als 80 % reduziert war (Abb. 1b, ergänzende Abb. 3d).

Wir haben die Strukturen von Chs1-PolyB und dem Chs1-NikkoZ-Komplex mit einer Auflösung von 3,6 Å bzw. 2,4 Å bestimmt (Ergänzende Abbildungen 4, 10). Ein Vergleich zwischen Chs1-Karten im Apo- und Inhibitor-gebundenen Zustand ergab deutlich verlängerte zusätzliche Dichten, die PolyB und NikkoZ im aktiven Zentrum entsprechen, was mit ihrer Funktion als substratkompetitive Inhibitoren übereinstimmt (ergänzende Abbildung 13). Die Nukleosideinheiten von PolyB und NikkoZ werden durch T453, M454, Y455 und K578 an der Spitze des aktiven Zentrums stabilisiert. Hierbei handelt es sich um dieselben Reste, die mit der Nukleosidgruppe von UDP-GlcNAc interagieren (Abb. 5a – d). Im Gegensatz zur flexiblen GlcNAc-Einheit von UDP-GlcNAc, die sich vom aktiven Zentrum weg erstreckt, erstrecken sich die Peptidyleinheiten von PolyB und NikkoZ in Richtung des Chitin-Transportkanals und gehen umfangreiche Wechselwirkungen mit E457, D602, A677 und W760 ein (Abb. 5a– D). Die einzigartige Architektur der Peptidyleinheit sorgt dafür, dass der Inhibitor im aktiven Zentrum von Chs1 eingeschlossen ist. Insbesondere hat NikkoZ aufgrund seiner größeren Gruppe in der Peptidyleinheit als PolyB zusätzliche Kontakte mit P675 und Q756 von Chs1 (Abb. 5c, d), was mit früheren Erkenntnissen übereinstimmt, dass Nikkomycin einen relativ niedrigeren Ki als Polyoxine aufweist 26, 37. Die einzigartigen Wechselwirkungen zwischen Chs1 und den Peptidyleinheiten von PolyB und NikkoZ weisen auch auf die höhere Bindungsaffinität dieser Inhibitoren gegenüber dem UDP-GlcNAc-Substrat hin. Außerdem ist die Schaltschleife von Chs1 in unseren Chs1-PolyB- und Chs1-NikkoZ-Strukturen offen. Bemerkenswert ist, dass der Endteil der Peptidyleinheiten von PolyB und NikkoZ die Bindungsstelle des GlcNAc-Akzeptors besetzt und somit den Chitin-Transportkanal blockiert. Daher legen unsere Strukturen nahe, dass die Peptidyl-Nukleosid-Inhibitoren Chitin-Synthasen über einen einzigartigen Mechanismus hemmen: Die Nukleosid-Einheit konkurriert mit der UDP-Bindung, und die Peptidyl-Einheit induziert die Öffnung der Schaltschleife und blockiert das Tor des Chitin-Transportkanals.

a Detaillierte Bindungsstelle von Polyoxin B. Schlüsselreste und Polyoxin B werden in Stäbchen angezeigt. b LIGPLOT-Schema für die Polyoxin B-Bindungsreste von Chs1. c Detaillierte Bindungsstelle von Nikkomycin Z. Schlüsselreste und Polyoxin B werden in Stäbchen angezeigt. d LIGPLOT-Schema für Nikkomycin Z-Bindungsreste von Chs1.

In dieser Arbeit haben wir erstmals gezeigt, dass die Proteolyseaktivierung von Chs1-Zymogen durch die Entfernung seiner N-terminalen Region erfolgt. Durch die Bestimmung der Struktur von dimerem Chs1 in den Zuständen Apo, Donorbeladung, Primer (UDP+GlcNAc-gebunden) und Donor+Akzeptorbindung konnten wir ein Arbeitsmodell für aktiviertes Chs1 vorschlagen (Abb. 6a). Im Apo-Zustand von Chs1 ist das mutmaßliche aktive Zentrum für die Donorbindung offen, wohingegen der mutmaßliche Chitin-Transportkanal durch eine Schaltschleife auf der zytosolischen Seite und durch TMH4 auf der exoplasmatischen Seite verschlossen ist. Dann bindet UDP-GlcNAc hauptsächlich über seine UDP-Einheit an das aktive Zentrum, während die GlcNAc-Einheit flexibel für die Selbstansaugung ist. Anschließend löst die Donorhydrolyse das Umlegen der Schaltschleife aus und öffnet das Tor vom aktiven Zentrum zum Transportkanal. Durch die Donorhydrolyse entsteht ein GlcNAc-Molekül in der Akzeptorbindungsstelle, dessen C4-Hydroxylgruppe zum aktiven Zentrum zeigt. Danach wird UDP freigesetzt und das zweite Donormolekül bindet das aktive Zentrum, wie im UDP-GlcNAc+GlcNAc-gebundenen Zustand von Chs1 gezeigt. Wir schlagen weiterhin vor, dass eine anschließende Substratbindung und -umwandlung eine glykosidische β(1 → 4)-Bindung mit dem Akzeptor GlcNAc erzeugt, um ein Disaccharid zu bilden. Chitin verlängert sich durch Wiederholung des Prozesses der Donorbindung und Hydrolyse. Schließlich verschiebt sich das flexible TMH4 nach außen und öffnet den Chitin-Transportkanal. Die Abwärtsverschiebung von GTD zur Membran während der Donorhydrolyse kann dazu beitragen, das Produkt herauszudrücken. Peptidylnukleosid-Inhibitoren hemmen Chitin-Synthasen, indem sie sowohl Donor- als auch Akzeptor-Bindungsstellen besetzen und den Chitin-Transportkanal blockieren (Abb. 6b).

Ein Chs1 im Apo-Zustand hat ein offenes aktives Zentrum und einen Transmembrankanal, der durch eine Schaltschleife und TMH4 verschlossen ist. Die Bindung des Zuckerdonors (UDP-GlcNAc) und die anschließende Hydrolyse bereiteten das erste Akzeptormolekül (GlcNAc) an der Bindungsstelle vor. Der Priming-Prozess öffnet den Chitin-Transportkanal auf der zytosolischen Seite durch Umlegen der Schaltschleife und löst die Abwärtsbewegung der GT-Domäne aus, um das Produkt herauszudrücken. Dann wird UDP freigesetzt und ein neues Donormolekül bindet an das aktive Zentrum für die Chitinverlängerung. Um das Chitinprodukt nach außen zu transportieren, wird TMH4 nach außen verlagert, wodurch auf der Exoplasmaseite ein offener Kanal entsteht. Weitere Einzelheiten finden Sie im Text. b Peptidylnukleosid-Inhibitoren hemmen Chs1, indem sie mit der UDP-Bindung konkurrieren, die Zuckerakzeptor-Bindungsstelle besetzen und den Chitin-Transportkanal blockieren. c Die Domänenaustauschschleife in einer Untereinheit reguliert die Aktivität der anderen Untereinheit, indem sie deren GTD hemmt und freigibt. Dies ermöglicht die gleichzeitige Chitinsynthese von zwei Untereinheiten im Chs1-Dimer und erleichtert die Bildung von Chitinfasern. Während der Chitinsynthese verschieben sich die Schaltschleife und TMH4 jeder Untereinheit, um den Chitintransportkanal zu öffnen.

Das aktive Zentrum und der Chitintransportkanal jeder Chs1-Untereinheit im Dimer sind unabhängig, aber die Domänenaustauschschleife in einer Untereinheit reguliert wahrscheinlich die Funktion der anderen Untereinheit, indem sie deren GTD hemmt und freisetzt. Dadurch erfolgt die Chitinsynthese der beiden Untereinheiten gleichzeitig, was wahrscheinlich für die Bildung von Chitinfasern wichtig ist (Abb. 6c). Da außerdem zwei benachbarte GlcNAc-Reste innerhalb der Chitinkette abwechselnd ausgerichtet sind, wurde in früheren Studien vorgeschlagen, dass die Chitinsynthase zwei aktive Stellen für jede Zuckerorientierung besitzt38. Unsere Struktur von Chs1 zeigte jedoch, dass jede Untereinheit nur ein aktives Zentrum hat und zwei aktive Zentren im Chs1-Dimer zu weit entfernt sind, um miteinander zu kooperieren. Weitere Forschung ist erforderlich, um den Mechanismus der Chitin-Verlängerung von Chs1 vollständig zu verstehen, einschließlich der Frage, wie GlcNAc-Reste in alternierenden Orientierungen verbunden werden. Die Erfassung von Chs1 im Komplex mit Chitin wird zweifellos weitere Einblicke in dieses Modell liefern.

Chitin-, Hyaluronan- und Cellulosesynthasen gehören alle zur GT-2-Familie. Ein Strukturvergleich ergab, dass Chs1 insgesamt Ähnlichkeit mit Hyaluronan- und Cellulosesynthasen aufweist (ergänzende Abbildung 18a, b) 16, 21, obwohl ihre Strukturdetails und ihr oligomerer Zustand unterschiedlich sind. Chitin-, Hyaluronan- und Cellulose-Synthasen haben eine ähnliche zytosolische Glykosyltransferase-Domäne und einen Transmembran-Polysaccharid-Transportkanal. Bemerkenswert ist, dass die GlcNAc-Einheit des UDP-GlcNAc-Donors im Komplex mit HAS der Akzeptorbindungsstelle zugewandt ist (ergänzende Abbildung 18c, d), was unsere Annahme stützt, dass die GlcNAc-Einheit von UDP-GlcNAc in Chs1 für Zucker nach innen gedreht werden muss überweisen.

Während der Erstellung dieses Manuskripts berichtete eine andere Gruppe über die Kryo-EM-Strukturen der Chitin-Synthase 2 aus Candida albicans (caChs2) in den Zuständen Apo, UDP-GlcNAc-gebunden, Nikkomycin Z-gebunden und Polyoxin D-gebunden.34 caChs2 und Chs1 aus Saccharomyces cerevisiae (scChs1) in unserer Arbeit weisen eine Sequenzidentität von ~50 % auf. Die Strukturen von caChs2 und scChs1 in vier verschiedenen Zuständen sind alle mit einer quadratischen Mittelabweichung (rmsd) von ~ 1,2 Å überlagerbar, was auf ihre hohe Ähnlichkeit hinweist (ergänzende Abbildung 20). Der im Strukturvergleich beobachtete wesentliche wesentliche Unterschied besteht darin, dass das konservierte VLPGA-Motiv (Schalterschleife) in Apo- und UDP-GlcNAc-gebundenem scChs1 geschlossen, in Apo- und UDP-GlcNAc-gebundenem caChs2 jedoch geöffnet ist. Dieser Unterschied wird wahrscheinlich durch den Artenunterschied oder das unterschiedliche Expressionssystem verursacht, das in zwei Arbeiten verwendet wurde (scChs1 in S. cerevisiae BY4742; caChs2 in sf9-Insektenzelle). Darüber hinaus sind das UDP-GlcNAc-Substrat und zwei Arten von Inhibitoren alle an ähnlichen Positionen in den Strukturen von caChs2 und scChs1 gebunden, was auf ähnliche katalytische und inhibitorische Mechanismen schließen lässt. Aufgrund des Fehlens von Strukturen in geprimten und UDP-GlcNAc+GlcNAc-gebundenen Zuständen wurden in der Arbeit von caChs2 keine detaillierten Katalysezyklen der Chitin-Synthase und die Regulierung des Chitin-Transportkanals durch TMH4 entdeckt. Auch die hemmende Funktion der Domain-Swapping-Schleife wurde in dieser Arbeit nicht definiert.

Zusammenfassend haben unsere systematischen strukturellen und biochemischen Studien von Chs1 tiefe Einblicke in die molekularen Mechanismen der Proteolyseaktivierung, der Glykosyltransferase-Aktivität und des Transmembran-Chitintransports einer Pilz-Chitin-Synthase sowie in die Hemmmechanismen von zwei Peptidyl-Nukleosid-Chitin-Synthase-Inhibitoren geliefert. Angesichts der entscheidenden Rolle der Chitin-Synthase bei pathogenen Pilzinfektionen bietet unsere Arbeit eine Plattform für die Entwicklung neuer kleiner antimykotischer Moleküle.

Wir haben Chs1 (Uniprot-ID: P08004) mit einem C-terminalen Dreifach-FLAG für den modifizierten pRS423-Vektor markiert (Ergänzungstabelle 2). Der Hefestamm BY4742 wurde transformiert und etwa 20 Stunden lang in synthetischem Histidin-Dropout-Medium (SD-His) kultiviert und dann 12 Stunden lang auf YPG-Medium (10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, 20 g D-Galactose pro Liter) übertragen vor der Ernte. Die Zellen wurden in Lysepuffer (20 mM Tris, pH 7,4, 0,2 M Sorbitol, 50 mM Kaliumacetat, 2 mM EDTA und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) resuspendiert und dann mit einer French Press bei 15.000 psi lysiert. Wir haben das Lysat bei zentrifugiert 10.000 × g für 30 Minuten bei 4 °C und der Überstand wurde für einen weiteren Zentrifugenzyklus bei 100.000 × g für 60 Minuten bei 4 °C gesammelt. Das Membranpellet wurde gesammelt und dann in Puffer A, der 10 % Glycerin, 20 mM Tris- enthielt, resuspendiert. HCl (pH 7,4), 1 % DDM, 0,1 % Cholesterylhydrogensuccinat (CHS), 500 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EDTA und 1 mM PMSF. Nach 30-minütiger Inkubation bei 4 °C wurde die Mischung zentrifugiert für 30 Minuten bei 100.000 × g, um die unlösliche Membran zu entfernen. Wir haben den Überstand in eine voräquilibrierte Anti-FLAG (M2)-Affinitätssäule (GenScript) bei 4 °C geladen und das Affinitätsgel mit Puffer B (20 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,01 % Laurylmaltoseneopentylglykol (LMNG), 0,0033 % GDN, 0,0013 % CHS und 1 mM MgCl2). Die Proteine ​​wurden mit Puffer B, der 0,15 mg/ml 3 × FLAG-Peptid enthielt, eluiert und weiter entfernt gereinigt in einer Superose 6 10/300-Gelfiltrationssäule in Puffer C (20 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,001 % LMNG, 0,00033 % GDN, 0,00013 % CHS und 1 mM MgCl2). Die gereinigten Proteine ​​wurden mittels SDS-PAGE bewertet und für die Kryo-EM-Analyse konzentriert. Wir haben eine Reihe von Detergenzien bei der Reinigung untersucht und festgestellt, dass LMNG/GDN/CHS das beste Detergens für die Herstellung eines Kryo-EM-Gitters ist und DDM/CHS das beste Detergenz für Stabilität und Ausbeute von Chs1 ist. Um das Experiment zu vereinfachen, wurde in den Aktivitätstests eine mit DDM/CHS gereinigte Probe verwendet.

Um verschiedene Zustände zu erfassen, wurde gereinigtes Chs1 direkt für die EM-Gittervorbereitung verwendet oder mit verschiedenen Substraten (5 mM UDP-GlcNAc, 5 mM GlcNAc oder 5 mM UDP) oder Inhibitoren (5 mM Nikkomycin Z oder 5 mM Polyoxin B) auf Eis gemischt . Nach der Inkubation wurden 2,5-μl-Aliquots von Chs1 mit einer Konzentration von ~3 mg/ml auf glimmentladene löchrige Kohlenstoffgitter (Quantifoil Au R1.2/1.3, 300 Mesh) gegeben und in flüssigem Ethan unter Verwendung eines FEI-Vitrobots schockgefroren Mark IV. Die Gitter wurden in einem 300-keV-FEI-TF30-Elektronenmikroskop der School of Basic Medical Sciences der Universität Peking untersucht. Kryo-EM-Daten wurden automatisch mit SerialEM in einem 300-keV-FEI-Titan-Krios-Elektronenmikroskop der Fakultät für Physik der Universität Peking und des Instituts für Biophysik der Chinesischen Akademie der Wissenschaften mit Defokussierungswerten im Bereich von –1,2 bis –2,5 μm gesammelt. Das Mikroskop wurde mit einem K3-Direktdetektor bei einer Nennvergrößerung von 225.000x betrieben. Die Gesamtdosen betrugen auf Probenebene 50–60 Elektronen pro Å2.

Wir verwendeten das Programm MotionCorr-2.039 zur Bewegungskorrektur und CTFFIND-4.140 zur Berechnung der Parameter der Kontrastübertragungsfunktion. Wir verwendeten RELION-3 für die Partikelauswahl und -extraktion und verwendeten CryoSPARC für alle verbleibenden Schritte36,41. Die Auflösung der Karten wurde anhand der Goldstandard-Fourier-Shell-Korrelation bei einem Korrelationsgrenzwert von 0,143 geschätzt.

Für die an Nikkomycin Z gebundene Chs1-Struktur haben wir 2711 Rohfilmaufnahmen gesammelt. Insgesamt wurden 4.135.734 Partikel automatisch für die 2D-Klassifizierung und heterogene Verfeinerung ausgewählt. Basierend auf der Qualität von drei heterogen verfeinerten 3D-Karten wurden 837.015 Partikel zur weiteren Verfeinerung und Nachbearbeitung zurückgehalten, was zu einer 3D-Karte mit einer durchschnittlichen Auflösung von 2,4 Å unter Verwendung der C2-Symmetrie führte.

Für die Chs1-Struktur im Apo-Zustand haben wir 3672 Rohfilmaufnahmen gesammelt. Insgesamt wurden 3.529.578 Partikel automatisch für die 2D-Klassifizierung und heterogene Verfeinerung ausgewählt. Basierend auf der Qualität von drei heterogen verfeinerten 3D-Karten wurden 1.342.168 Partikel zur weiteren Verfeinerung und Nachbearbeitung zurückgehalten, was zu einer 3D-Karte mit einer durchschnittlichen Auflösung von 3,0 Å unter Verwendung der C2-Symmetrie führte.

Für die UDP-GlcNAc+GlcNAc-gebundene Chs1-Struktur haben wir 1252 Rohfilmaufnahmen gesammelt. Insgesamt wurden 996.080 Partikel automatisch für die 2D-Klassifizierung und heterogene Verfeinerung ausgewählt. Basierend auf der Qualität von drei heterogen verfeinerten 3D-Karten wurden 208.320 Partikel zur weiteren Verfeinerung und Nachbearbeitung zurückgehalten, was zu einer 3D-Karte mit einer durchschnittlichen Auflösung von 3,1 Å unter Verwendung der C2-Symmetrie führte.

Für die UDP-GlcNAc-gebundene Chs1-Struktur haben wir 1076 Rohfilmaufnahmen gesammelt. Insgesamt wurden 1.036.417 Partikel automatisch für die 2D-Klassifizierung und heterogene Verfeinerung ausgewählt. Basierend auf der Qualität von drei heterogen verfeinerten 3D-Karten wurden 330.289 Partikel zur weiteren Verfeinerung und Nachbearbeitung zurückgehalten, was zu einer 3D-Karte mit einer durchschnittlichen Auflösung von 3,1 Å unter Verwendung der C2-Symmetrie führte.

Für die UDP+GlcNAc-gebundene Chs1-Struktur (grundierter Zustand) haben wir 2469 rohe Filmmikroskopaufnahmen gesammelt. Insgesamt wurden 1.059.472 Partikel automatisch für die 2D-Klassifizierung und heterogene Verfeinerung ausgewählt. Basierend auf der Qualität von drei heterogen verfeinerten 3D-Karten wurden 184.449 Partikel zur weiteren Verfeinerung und Nachbearbeitung zurückgehalten, was zu einer 3D-Karte mit einer durchschnittlichen Auflösung von 3,1 Å unter Verwendung der C2-Symmetrie führte.

Für die UDP-gebundene Chs1-Struktur haben wir 632 Rohfilmaufnahmen gesammelt. Insgesamt wurden 431.546 Partikel automatisch für die 2D-Klassifizierung und heterogene Verfeinerung ausgewählt. Basierend auf der Qualität von drei heterogenen verfeinerten 3D-Karten wurden 115.773 Partikel zur weiteren Verfeinerung und Nachbearbeitung zurückgehalten, was zu einer 3D-Karte mit einer durchschnittlichen Auflösung von 3,6 Å unter Verwendung der C2-Symmetrie führte.

Für die Chs1-Struktur im Apo-Zustand nach Inkubation mit GlcNAc haben wir 1564 Rohfilmaufnahmen gesammelt. Insgesamt wurden 1.077.654 Partikel automatisch für die 2D-Klassifizierung und heterogene Verfeinerung ausgewählt. Basierend auf der Qualität von drei heterogen verfeinerten 3D-Karten wurden 218.698 Partikel zur weiteren Verfeinerung und Nachbearbeitung zurückgehalten, was zu einer 3D-Karte mit einer durchschnittlichen Auflösung von 3,5 Å unter Verwendung der C2-Symmetrie führte.

Für die an Polyoxin B gebundene Chs1-Struktur haben wir 2311 Rohfilmaufnahmen gesammelt. Insgesamt wurden 2.608.153 Partikel automatisch für die 2D-Klassifizierung und heterogene Verfeinerung ausgewählt. Basierend auf der Qualität von drei heterogenen verfeinerten 3D-Karten wurden 142.887 Partikel zur weiteren Verfeinerung und Nachbearbeitung zurückgehalten, was zu einer 3D-Karte mit einer durchschnittlichen Auflösung von 3,6 Å unter Verwendung der C2-Symmetrie führte.

Wir haben die von Alphafold2 vorhergesagte Chs1-Struktur als Ausgangsmodell42,43 verwendet, sie in unsere Karte eingepasst und sie in COOT44 und Chimera45 korrigiert. Das vollständige Chs1-Modell wurde durch Realraumverfeinerung im PHENIX-Programm46 verfeinert und anschließend manuell in COOT angepasst. Abschließend wurde das Modell mit MolProbity47 validiert. Strukturfiguren wurden in Chimera und PyMOL erstellt (https://pymol.org/2/).

Die Aktivität von Chs1 wurde mit dem UDP-Glo™ Glykosyltransferase-Assay von Promega (Katalog: V6961) gemessen, der die Aktivität jeder Glykosyltransferase (GT) messen kann, die einen UDP-Zucker als Substrat verwendet. Jede Reaktion enthielt 0,125 μg gereinigtes Protein, 20 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,025 % DDM, 0,0025 % CHS und 10 mM MgCl2, 10 mM GlcNAc und 10 mM UDP-GlcNAc in einem Gesamtvolumen von 5 μl. Die Mischung wurde zunächst 60 Minuten lang bei 30 °C inkubiert und dann 5 μl UDP-Nachweisreagenz hinzugefügt. Die Mischung wurde 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend wurde die Lumineszenz mit einem Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader (BioTek) nachgewiesen.

Die Chitin-Synthase-Aktivität wurde mit der von Lucero beschriebenen Methode mit einigen Modifikationen bewertet27. Der Assay umfasst im Wesentlichen zwei Schritte: Bindung von synthetisiertem Chitin an eine WGA-beschichtete Oberfläche und Nachweis des Polymers mit einem Meerrettich-Peroxidase-WGA-Konjugat. Die Meerrettich-Peroxidase-Aktivität kann anhand der Absorption bei 600 nm bestimmt werden, und die Werte werden unter Verwendung von handelsüblichem Chitin als Standard in Chitinmengen umgerechnet. Zunächst wurden die Vertiefungen von 96-Well-Platten mit WGA (Weizenkeim-Agglutinin) vorbeschichtet. Dann wurden 100 μl Reaktionslösung mit 3,4 μg gereinigtem Protein, 20 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,025 % DDM, 0,0025 % CHS, 1 mM MgCl2, 2 mM GlcNAc und 1 mM UDP-GlcNAc zugegeben und 60 Minuten lang inkubiert min bei Zimmertemperatur. Nachdem die Lösung in den Vertiefungen entfernt worden war, wurden 100 μl WGA-HRP (Weizenkeim-Agglutinin – Pferderötlich-Peroxidase) in einer Konzentration von 1 μg/ml in Pufferlösung (0,2 mM HEPES bei pH 7,4) in jede Vertiefung gegeben und bei 100 °C kultiviert 37 °C für 20 Min. Anschließend wurde die Lösung in den Vertiefungen entfernt und die Vertiefungen dreimal mit Pufferlösung gewaschen. In jede Vertiefung wurden 100 μl 1-Step Ultra TMB-ELISA-Substratlösung gegeben und die Gemische wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur luzifugiert umgesetzt. Schließlich wurden alle Reaktionen durch 100 μl 0,5 M H2SO4 gestoppt und UV-Vis-Absorptionsspektren wurden auf einem Mikroplatten-Lesegerät bei 450 nm mit einem Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader (BioTek) aufgezeichnet.

Die Proteinbanden im SDS-PAGE-Gel wurden zunächst geschnitten und durch In-Gel-Verdau verarbeitet. Nach der Entfärbung und reduktiven Alkylierung wurden die Gelstücke mit 500 ng Trypsin in 100 μl 50 mM NH4HCO3 über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die mit Trypisn verdauten Peptide wurden dann aus dem Gel eluiert und im Vakuum getrocknet. Die Nano-LC-MS/MS-Experimente wurden dann mit einem LTQ-Orbitrap-Velos-Pro-Massenspektrometer (Thermo Electron, Bremen, Deutschland) durchgeführt. Jede Probe wurde in eine C18-Umkehrphasensäule (Thermo Electron, Bremen, Deutschland) geladen. Die Peptidmischungen wurden mit einem 0–40 %-Gradienten (Puffer A, 0,1 % Ameisensäure, Puffer B, 0,1 % Ameisensäure und 100 % ACN) über 60 Minuten eluiert und im Massenspektrometer unter Verwendung einer datenabhängigen TOP10-Methode nachgewiesen. Die allgemeinen massenspektrometrischen Bedingungen waren: Sprühspannung 2,2 kV; kein Mantel- und Hilfsgasfluss; Temperatur der Ionentransferröhre bei 250 °C; 35 % normalisierte Kollisionsenergie für MS/MS (MS2). Die Schwellenwerte für die Ionenselektion lagen für MS2 bei 1000 Zählungen. Bei MS2-Erfassungen wurde eine Aktivierung q = 0,25 und eine Aktivierungszeit von 30 ms angewendet. Das Massenspektrometer wurde im Positivionenmodus betrieben und es wurde eine datenabhängige automatische Umschaltung zwischen MS- und MS/MS-Erfassungsmodus eingesetzt. Für jeden Zyklus ein vollständiger MS-Scan im Orbitap, gefolgt von zehn MS2 im LTQ für die zehn intensivsten Ionen. Ausgewählte Ionen wurden 30 s lang von der weiteren Auswahl ausgeschlossen. Die endgültigen LC-MS/MS-Daten wurden einer Datenbanksuche mit der S. cerevisiae-Sequenzbibliothek in der Uniprot-Proteinsequenzdatenbank unter Verwendung des Sequest HT-Algorithmus im Softwarepaket Proteome Discoverer 1.4 (Thermo Scientific) übermittelt.

Unlösliches Chitin wurde gemäß dem obigen Chitin-Synthesetest synthetisiert und durch Zentrifugation gesammelt. Das Chitin wurde gewaschen und mit Puffer (50 mM NaH2PO4, pH 6,0) resuspendiert. Die Chitinase (C6137, Sigma, 0,5 mg/ml) wurde zugegeben und 24 Stunden bei 37 °C inkubiert.

Wir haben den Chs1-Knockout-Stamm (ΔChs1) im W303-Stamm hergestellt (Ergänzungstabelle 2). Chs1-Mutanten und Verkürzungen (N456A/E457A, K578A, D602A, S657F/N658F, K662M, V673S, L674Q, P675L, P675T, G676L, R718L, D745R, E752R, Q756L, R759A, W760A, S88 3F/S917F und Δ975-1024) wurden unter Verwendung des Plasmids pRS423-His3 konstruiert und in den ΔChs1-Stamm transformiert (Ergänzungstabelle 2). Die Zellen wurden zunächst in SD-Medium bei 30 °C bis zum gleichen OD-Wert von 1,0 gezüchtet. Die Mikroskopie wurde mit einem Umkehrmikroskop OLYMPUS CKX53 bei einer 400-fachen Vergrößerung durchgeführt. Die Bildaufnahme und -analyse erfolgte mit dem Programm ToupView 3.7. Die angezeigten mikroskopischen Bilder von Kontroll- und Knockout-/Mutantenproben wurden gleichermaßen unter Verwendung derselben Helligkeits- und Kontrastwerte angepasst. Hefezellen wurden kurz mit Wasser gewaschen und sofort in Wasser bei Raumtemperatur abgebildet.

Calcofluor White (CFW) ist ein unspezifischer Fluorochromfarbstoff für 1,3-β- und 1,4-β-verknüpfte Polysaccharide und zeigt Fluoreszenz, wenn er langwelligem Ultraviolett ausgesetzt wird. Die Färbung von synthetisiertem Chitin durch CFW wurde durch eine Modifikation des vorherigen Verfahrens28,29,30 durchgeführt. Wir bereiten 20 μL Reaktionslösung vor, die 3 μg gereinigtes Protein, 20 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,025 % DDM, 0,0025 % CHS, 1 mM MgCl2, 2 mM GlcNAc und 2 mM UDP-GlcNAc enthält, und inkubieren für 0, 1 bzw. 24 h bei 30 °C. Abschließend wurden der Reaktionslösung 10 mM EDTA zugesetzt, um die Reaktion zu stoppen. Um synthetisiertes Chitin sichtbar zu machen, geben wir 3 μl der Reaktionslösung auf einen sauberen Glasobjektträger, fügen dann 3 μl Calcofluor White Stain und das gleiche Volumen 10 % Kaliumhydroxid hinzu, decken die Probe mit einem Deckglas ab und lassen sie den Farbstoff absorbieren 1 Minute. Schließlich wurde das gefärbte Chitin mit einem automatischen inversen Forschungsfluoreszenzmikroskop Leica DMI4000 B unter ultravioletten Strahlen bei 200- bis 400-facher Vergrößerung nachgewiesen. Die Bildaufnahme und -analyse erfolgte mit dem Programm Leica Application Suite X.

Blue Native PAGE wurde unter nicht denaturierenden Bedingungen in Gelen (1,0 mm Dicke) mit 4–15 % Polyacrylamid durchgeführt. Es wurde in Blue Native PAGE-Elektrophorese-Laufpuffer (Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.) bei 100 V für 15 Stunden durchgeführt.

SDS-PAGE wurde zuerst in Gelen (1,0 mm Dicke) durchgeführt, die 4–12 % Polyacrylamid enthielten. Anschließend wurden die Proteine ​​im SDS-PAGE-Gel auf eine Polyvinylidenfluoridmembran übertragen. Monoklonaler Anti-Flag-Maus-Antikörper (Abcam, Katalog: ab125243, Klon: FG4R) und HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (H + L) (Proteintech, Katalog: SA00001-1) wurden zum Blotten im Verhältnis 1:1000 und 1 verwendet: Verdünnungsverhältnis jeweils 5000.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Kryo-EM-3D-Karten und die entsprechenden Atommodelle von Chs1 wurden in der EMDB-Datenbank und der RCSB-PDB mit den jeweiligen Zugangscodes EMD-36856 und 8K3Q (Apo-Zustand), EMD-36857 und 8K3R (GlcNAc-inkubierter Apo-Zustand) hinterlegt. , EMD-36863 und 8K3W (UDP-GlcNAc+GlcNAc-gebundener Zustand), EMD-36862 und 8K3V (UDP-GlcNAc-gebundener Zustand), EMD-36861 und 8K3U (geprimter UDP+GlcNAc-gebundener Zustand), EMD-36859 und 8K3T (UDP gebundener Zustand), EMD-36855 und 8K3P (PolyB-gebundener Zustand) und EMD-36864 und 8K3X (NikkoZ-gebundener Zustand). Auf andere für die Analyse in diesem Artikel verwendete Modelle kann in der RCSB-PDB-Datenbank mit ihren jeweiligen Zugangscodes zugegriffen werden: UDP-GlcNAc-gebundenes HAS (PDB-ID: 7SP8), CesA (PDB-ID: 7D5K) und Candida albicans Chs2 in apo (PDB-ID). : 7STL), UDP-GlcNAc-gebundene (PDB-ID: 7STM), NikkoZ-gebundene (PDB-ID: 7STN) und Polyoxin-gebundene (PDB-ID: 7STO) Zustände. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Kryo-EM-Daten wurden auf der Kryo-EM-Plattform am Center for Biological Imaging (CBI, cbi.ibp.ac.cn) am Institut für Biophysik der Chinesischen Akademie der Wissenschaften und im Elektronenmikroskopielabor der Universität Peking gesammelt. Wir danken Xuemei Li, Zhenxi Guo, Boling Zhu, Xujing Li und Xiaojun Huang für die Unterstützung bei der Datenerfassung. Wir danken Kailong Li und Qing Li von der Peking-Universität für die Bereitstellung experimenteller Instrumente und Materialien. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (32171212 an LB, Nr. 32071207 an CY), der Fundamental Research Funds for the Central Universities (an LB), der Peking University (an LB) und der National Basic Research unterstützt Programm von China (973-Programm, Nr. 2012CB917202 an CY).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Dan-Dan Chen, Zhao-Bin Wang.

Abteilung für Biochemie und Biophysik, School of Basic Medical Sciences, Peking-Universität, Peking, China

Dan-Dan Chen, Zhao-Bin Wang, Le-Xuan Wang, Peng Zhao, Cai-Hong Yun und Lin Bai

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DC, ZW, CY und LB konzipierten und gestalteten die Experimente. DC, ZW, LW, PZ und LB führten die Experimente durch. DC, ZW, CY und LB analysierten die Daten. LB hat das Manuskript unter Mitwirkung aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Cai-Hong Yun oder Lin Bai.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Jochen Zimmer und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Chen, DD., Wang, ZB., Wang, LX. et al. Struktur, Katalyse, Chitintransport und selektive Hemmung der Chitinsynthase. Nat Commun 14, 4776 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40479-4

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Eingegangen: 11. August 2022

Angenommen: 28. Juli 2023

Veröffentlicht: 08. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40479-4

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