Aufklärung des Mechanismus von Weissella

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 17128 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Der Mechanismus, durch den Milchsäurebakterien die Lebensdauer von Caenorhabditis elegans verlängern, wurde bereits zuvor aufgeklärt. Die Rolle der Weissella-Arten wurde jedoch noch nicht untersucht. Wir zeigen, dass Weissella koreensis und Weissella cibaria die Lebensdauer von C. elegans im Vergleich zu Escherichia coli OP50 signifikant verlängern (p < 0,05) und die Expression mehrerer Gene im Zusammenhang mit der Verlängerung der Lebensdauer induzieren (daf-16, aak-2, jnk-1, sod-3 und hif-1). Die orale Verabreichung von Weissella veränderte die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), verringerte die Akkumulation von Lipofuscin und erhöhte die Bewegungsaktivität (was zu einer Verzögerung des Alterns führt). Darüber hinaus wiesen mit Weissella gefütterte C. elegans im Vergleich zu mit E. coli OP50 gefütterten Würmern geringere Körpergrößen, Brutgrößen, ATP-Werte und Rachenpumpraten auf. Darüber hinaus veränderten Mutationen in sod-3, hif-1 oder skn-1 die Verlängerung der Lebensdauer im Vergleich zum Wildtyp von C. elegans nicht. Bei Mutanten mit Funktionsverlust von daf-16, aak-2 und jnk-1 gelang es C. elegans jedoch nicht, die Lebensdauer zu verlängern, was die mögliche Rolle dieser Gene bei der durch Weissella verursachten Langlebigkeit bei C. elegans unterstreicht. Weissella-Arten verlängern die Lebensdauer von C. elegans, indem sie DAF-16 über den c-Jun N-terminalen Kinase (JNK)-Weg aktivieren, der mit Stressreaktionen zusammenhängt, und den AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK)-Weg, der durch Ernährungseinschränkungen aktiviert wird .

Weissella-Arten sind Milchsäurebakterien, die erst kürzlich als neue Gattung klassifiziert wurden. Weissella-Arten kommen in fermentierten Lebensmitteln vor, darunter traditionelles koreanisches fermentiertes Gemüse und Kimchi, Zuckerrohr sowie im Darmtrakt von Menschen und anderen Tieren1. Fermentierte Lebensmittel, einschließlich Kimchi, besitzen verschiedene Milchsäurebakterien, deren Zusammensetzung die Fermentation und die sensorischen Eigenschaften von Kimchi beeinflusst2. Kimchi ist ein bekanntes probiotisches Lebensmittel mit ähnlichen gesundheitlichen Vorteilen wie probiotischer Joghurt. Darüber hinaus hat Kimchi eine Reihe weiterer gesundheitlicher Vorteile, darunter die Förderung der Gehirn-, Haut- und Darmgesundheit sowie die Stärkung des Immunsystems; Kimchi hat sich als wirksam gegen Krebs, Fettleibigkeit, Verstopfung und hohen Cholesterinspiegel erwiesen; es hat auch fibrolytische, antioxidative und Anti-Aging-Eigenschaften3. Kürzlich wurden Weissella-Arten als einer der Hauptfermenter in Kimchi2 identifiziert. Weissella-Arten sind im Vergleich zu Leuconostoc-Arten resistenter gegen saure und anaerobe Bedingungen4. Weissella verfügt außerdem über ungewöhnliche Interpeptidbrücken in der Peptidoglykanschicht, die diese Bakterien von anderen Laktobazillen unterscheiden5. Im Gegensatz zu anderen Milchsäurebakterien sind die möglichen positiven Wirkungen von Weissella spp. auf den Menschen bedürfen weiterer Untersuchungen.

Caenorhabditis elegans ist ein kleiner, frei lebender Bodennematode, der in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt wird. C. elegans ist aufgrund seiner kurzen Lebensdauer und der Tatsache, dass es für genetische Analysen zugänglich ist, ein besonders nützliches Modell zur Untersuchung des Alterns6. Die Bereitstellung von Milchsäurebakterien als Nahrungsquelle anstelle von E. coli OP50 erhöht die durchschnittliche Lebensdauer von C. elegans7,8,9. Mehrere Studien haben die Mechanismen beschrieben, durch die Milchsäurebakterien die Lebensdauer von C. elegans verlängern, die Rolle der Weissella-Arten bleibt jedoch unbekannt. Lactobacillus rhamnosus verlängert die Lebensdauer von C. elegans durch Modulation des DAF-2/DAF-16-Signalwegs10 und erleichtert die Resistenz von C. elegans gegen oxidativen Stress, wie durch die erhöhte Überlebensrate von C. elegans bei H2O2-induziertem Stress gezeigt wird. Bifidobacterium infantis verlängert die Lebensdauer von C. elegans durch dosisabhängige Aktivierung von skn-1 (das durch den p38-MAPK-Signalweg reguliert wird); Dieser Effekt wurde nicht durch eine Einschränkung der Ernährung hervorgerufen, was bedeutet, dass B. infantis die Langlebigkeit nicht durch die Aktivierung des Wirtsabwehrsystems über DAF-169 förderte. Es hat sich gezeigt, dass eine Einschränkung der Ernährung die Lebenserwartung von Tieren, einschließlich Menschen, verlängert11; Dies bleibt jedoch umstritten12. Es ist nicht klar, ob Milchsäurebakterien zu einer Einschränkung der Ernährung führen und dadurch die Lebensdauer von C. elegans verlängern. Eine Einschränkung der Ernährung kann die Lebensdauer von C. elegans über die Insulin/IGF-1-Signalwege (IIS) und das Ziel von Rapamycin (TOR) regulieren13. Diese (und andere) Wege induzieren den DAF-16/FOXO-Transkriptionsfaktor14, der wiederum verschiedene Gene reguliert, die an der Regulierung von Langlebigkeit, Stressreaktion, Stoffwechsel und Entwicklung beteiligt sind. DAF-16/FOXO ist daher sowohl für die Stressresistenz als auch für die Lebensspannenregulierung unverzichtbar15. Darüber hinaus wird JNK-1 mit der Stressreaktion bei Wirbeltieren in Verbindung gebracht und ist ein positiver Regulator von DAF-16. Darüber hinaus ist AAK-2, das C. elegans-Homolog von AMPK, an der DAF-16/FOXO-Aktivierung beteiligt und fördert die Langlebigkeit in Zeiten der Glukoserestriktion16.

In dieser Studie haben wir untersucht, ob Weissella-Arten die Lebensdauer von C. elegans verlängern. Wir haben auch einen Anziehungstest für C. elegans gegenüber Weissella-Arten und E. coli OP50 durchgeführt. Um den Mechanismus aufzuklären, der der durch Weissella vermittelten Verlängerung der Lebensdauer von C. elegans zugrunde liegt, wurde die Lebensdauer von Würmern mithilfe von Mutanten mit Funktionsverlust gemessen.

Die Fütterung von Nematoden auf einem Rasen von W. koreensis oder W. cibaria erhöhte signifikant (p < 0,001) die mittlere Lebensdauer (MLS) der Würmer im Vergleich zu der Gruppe, die auf dem Rasen mit E. coli OP50 gefüttert wurde (Tabelle 1). W. koreensis war bei der Erhöhung des MLS von Würmern wirksamer als W. cibaria. Die Überlebensraten der Würmer waren nach 13 Tagen sowohl bei mit W. cibaria als auch mit W. koreensis gefütterten Würmern höher als bei mit E. coli OP50 gefütterten Würmern (Abb. 1). Die vollständigen Daten zur Lebensdauer von Wildtyp- und Mutanten-C. elegans sind in Tabelle S1 aufgeführt.

Die Wirkung von Weissella auf die Lebensdauer von C. elegans (N2).

Nachdem sie drei Tage lang auf einem E. coli OP50-Rasen gefüttert worden waren, wurden junge erwachsene Würmer auf eine frische mNGM-Platte übertragen, die mit E. coli OP50, W. koreensis oder W. cibaria besät war; ***p < 0,001.

Um die Wirkung von Weissella auf die ROS-Produktion in C. elegans zu bestimmen, wurden die gesamten ROS-Werte von Würmern gemessen, die mit E. coli OP50 oder Weissella gefüttert wurden. Die beiden Weissella-Arten zeigten gegensätzliche Auswirkungen auf die ROS-Produktion (Abb. S1), wobei die ROS-Werte bei mit W. koreensis gefütterten und mit W. cibaria gefütterten C. elegans um 43,7 % niedriger bzw. 37,5 % höher waren als bei gefütterten C. elegans E. coli OP50.

Zu den altersbedingten Veränderungen bei C. elegans gehören Veränderungen der Körperbewegung, der Rachenpumprate und der Körpergröße. Die Akkumulation von Lipofuscin (ein Biomarker des Alterns) kann durch Autofluoreszenz bestimmt werden, es gibt jedoch erhebliche interindividuelle Unterschiede in den Lipofuscinspiegeln bei altersentsprechenden C. elegans17. Wir fanden heraus, dass die Autofluoreszenz bei mit Weissella gefütterten Würmern im Vergleich zu mit E. coli OP50 gefütterten Würmern signifikant abnahm (Abb. 2). Obwohl die Lipofuscin-Fluoreszenz am 14. Tag in der mit E. coli OP50 gefütterten Gruppe im Vergleich zu den beiden mit Weissella gefütterten Gruppen signifikant höher war, zeigte keine der drei Gruppen große Mengen an Lipofuscin. Am 16. Tag betrugen die Lipofuscinspiegel in den W. koreensis- und W. cibaria-Gruppen 35,1 % bzw. 22,9 % des in der E. coli OP50-Gruppe beobachteten Spiegels. Nach 18 Tagen stiegen die Lipofuscinspiegel in den Gruppen W. koreensis und W. cibaria auf 86,9 % bzw. 75,3 % des in E. coli OP50 beobachteten Werts.

Lipofuscin-Akkumulation in mit C. elegans (N2) gefütterten E. coli OP50, W. koreensis und W. cibaria.

(a) Fluoreszenz von Lipofuscin in Würmern, die an den Tagen 14, 16 und 18 mit E. coli OP50, W. koreensis und W. cibaria gefüttert wurden. Maßstabsbalken = 100 μm. (b) Die Fluoreszenz wurde mit der ImageJ-Software quantifiziert. Die Grafik zeigt den mittleren Prozentsatz in willkürlichen Einheiten im Verhältnis zu dem der Kontrollwürmer, denen E. coli OP50 am 14. Tag verabreicht wurde. Für jede Messung wurden zehn Würmer verwendet; **p < 0,01, ***p < 0,001.

Wir haben die Bewegungsgeschwindigkeit von C. elegans an den Tagen 4, 7, 10, 13 und 16 gemessen und festgestellt, dass der Anteil der Würmer, die eine sinusförmige Fortbewegung (Klasse A) zeigten, bei mit Weissella gefütterten Würmern höher war als bei Würmern, die mit E. coli OP50 gefüttert wurden ( Abb. 3). Die Körpergröße nahm in allen Gruppen mit dem Alter zu; Allerdings waren die mit Weissella gefütterten Würmer kleiner als die mit E. coli gefütterten Würmer (Abb. 4a). Unterdessen war die Brutgröße bei mit Weissella gefütterten Würmern kleiner als in der Kontrollgruppe (Abb. 4b). Interessanterweise waren die Fortpflanzungsperioden in den mit Weissella gefütterten Gruppen etwas länger als in der mit E. coli OP50 gefütterten Gruppe. Die mittlere Gesamtbrutgröße für jedes Wurmpaar betrug 237, 84 bzw. 74 bei Würmern, die mit E. coli OP50, W. koreensis und W. cibaria gefüttert wurden.

Die Bewegungsaktivität von C. elegans (N2), gefüttert mit E. coli OP50 oder Weissella.

Würmer im L4-Stadium, die nach dem Schlüpfen 3 Tage lang mit E. coli OP50 gefüttert wurden, wurden auf frische mNGM-Platten mit 20 mg E. coli OP50 oder Weissella-Rasen übertragen. Nematoden wurden basierend auf ihrer Fortbewegung in vier Klassen eingeteilt: Klasse (A) normale koordinierte sinusförmige Fortbewegung; Klasse (B) unkoordinierte und/oder träge Bewegung; Klasse (C): keine Bewegung außer Kopf oder Schwanz als Reaktion auf Anstupsen; und tote Würmer der Klasse (D). Die Balken geben den Anteil jeder Klasse zum angegebenen Zeitpunkt an.

Einfluss von Weissella auf die Körpergröße und Brutgröße von C. elegans (N2).

(a) C. elegans im L4-Stadium wurden am dritten Tag auf frische mNGM-Platten übertragen, die mit jeder Bakterienart besät waren, und die Körpergröße wurde anhand von 20 Würmern für jede Bakterienart bestimmt. (b) Die Gesamtbrutgröße wurde von 30 Tieren bestimmt und die Werte stellen den Mittelwert für jedes Wurmpaar dar. Die gezeigten signifikanten Unterschiede beziehen sich auf E. coli OP50 (*p < 0,05, ***p < 0,001).

Als nächstes bestimmten wir die Menge der Nahrungsaufnahme, indem wir die Pumprate des Rachens maßen. Eine Verringerung der pharyngealen Pumprate kann zu einer Einschränkung der Ernährung führen, indem die Nahrungsaufnahme eingeschränkt wird (ähnlich wie es bei Eat-2-Mutanten der Fall ist)18. Die Pumprate wurde 30 Minuten nach der Übertragung der Würmer auf E. coli OP50- oder Weissella-Platten gemessen, indem die Anzahl der Kontraktionen im Endbulbus des Pharynx (Abb. 5a) 1 Minute lang gezählt wurde. Die Pumprate der auf dem Weissella-Rasen gewachsenen Würmer nahm nach 3 Tagen signifikant ab (p < 0,05) (Abb. 5b). Die Pumprate wurde dann alle 24 Stunden vom 4. bis zum 10. Tag gemessen, wobei die Pumprate der Weissella-Gruppe niedriger war als die der E. coli-Gruppe (Abb. 5c). Unabhängig von der Bakterienart nahm die Pumprate mit zunehmendem Alter ab.

Die pharyngeale Pumprate von C. elegans (N2), gefüttert mit E. coli OP50 und Weissella.

Die Pumprate wurde im Endkolben (a) gemessen. Der Maßstabsbalken repräsentiert 50 μm. (b) Die Pumprate von 3 Tage alten Würmern, gemessen 30 Minuten lang, nachdem die Würmer auf eine frische mNGM-Platte übertragen wurden, die mit jeder Bakterienart besiedelt war. (c) Die Pumprate bei alternden Würmern, ermittelt aus dem Mittelwert von 20 Würmern für jede Bakterienart. Die gezeigten signifikanten Unterschiede beziehen sich auf E. coli OP50 (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

Da der ATP-Spiegel sowohl mit der Ernährungseinschränkung19 als auch mit dem AMPK-Signalweg zusammenhängt, haben wir den ATP-Spiegel gemessen und festgestellt, dass Würmer, die mit W. koreensis und W. cibaria gefüttert wurden, im Vergleich zu Würmern, die mit E . coli OP50 (Abb. S2). Daher beeinflusst Weissella den ATP-Gehalt in C. elegans, insbesondere in W. cibaria, erheblich, was die ATP-Produktion drastisch verringerte.

Es ist bekannt, dass C. elegans bestimmte Bakterienstämme bevorzugt20. Ein Chemotaxis-Assay wurde durchgeführt, um zu beweisen, dass der Effekt der Verlängerung der Lebensdauer von Weissella nicht auf einer Präferenz zwischen E. coli OP50 und Weissella beruht. Die Ergebnisse zeigten, dass C. elegans 30 Minuten nach der Fütterung der Teststämme E. coli OP50 gegenüber Weissella zu bevorzugen schien; Allerdings war die Anzahl der Würmer im Kreis (siehe Abb. S3) um E. coli OP 50 oder Weissella in jedem Test 60 Minuten nach der Fütterung der Teststämme ähnlich (mehr als 300 Würmer), was bedeutet, dass dies bei C. elegans der Fall war zeigen nach 60 Minuten keine Präferenz zwischen E. coli OP50 und Weissella (Tabelle S2). Interessanterweise schienen viele Würmer 30 Minuten nach der Fütterung mit den Testverbindungen Milchsäure (125,0 ± 4,00) zu bevorzugen, und auch hier war die Anzahl der Würmer im Kreis 60 Minuten nach der Fütterung in jedem Test ähnlich (mehr als 300 Würmer). Milchsäure oder 95 %iges Ethanol.

Wir untersuchten die Expression altersbedingter Gene, einschließlich derjenigen, die an der Ernährungseinschränkung bei C. elegans beteiligt sind, um den Mechanismus der Lebensverlängerung bei mit Weissella gefütterten C. elegans zu bestimmen. An den in Tabelle S3 gezeigten Genen wurde eine quantitative Echtzeit-PCR (qRT) durchgeführt. In mit Weissella gefütterten Würmern waren daf-16, sod-3, jkk-1, jnk-1 und aak-2 signifikant überexprimiert (Abb. S4), insbesondere in Würmern, die mit W. cibaria gefüttert wurden, wo alle Gene außer daf-2 vorhanden waren im Vergleich zur E. coli OP50-Kontrollgruppe um mehr als das Zweifache hochreguliert, wobei daf-16 und sod-3 um das 3,9-fache bzw. 2,3-fache hochreguliert waren. Unterdessen stieg in der W. koreensis-Gruppe die Expression von daf-16, sod-3, jkk-1, jnk-1 und aak-2 an, allerdings in geringerem Ausmaß als in der W. cibaria-Gruppe, und es gab keine signifikanten Anstiege bei daf -2- und hif-1-Ausdruck. Die anderen in dieser Studie beobachteten Gene zeigten im Vergleich zu den mit E. coli OP50 gefütterten Würmern keine signifikanten Steigerungen (Abb. S4).

Wir analysierten die Kernlokalisation von DAF-16 mithilfe transgener Stämme, die das Fusionsprotein DAF-16::GFP exprimieren (Abb. 6b). Weissella-Arten induzierten einen Anstieg der nuklearen DAF-16::GFP-Translokation (E. coli OP50: 22,4 %; W. koreensis: 73,3 %; W. cibaria: 75,0 %) und eine Verringerung der zytosolischen DAF-16::GFP-Fraktion (E. coli OP50: 41,5 %; W. koreensis: 6,7 %; W. cibaria: 9,4 %) (Abb. 6c).

Weissella-Arten induzierten eine nukleare Translokation von DAF-16::GFP.

(a) Abhängig vom Grad der nuklearen GFP-Fluoreszenz können drei verschiedene Zustände der Translokation von DAF-16::GFP aus dem Zytoplasma in Zellkerne unterschieden werden: zytosolisch (Zyt, links; keine nukleare GFP-Fluoreszenz), intermediär (int, Mitte; schwache nukleare GFP-Fluoreszenz) und nukleare (nuc, rechts; starke nukleare GFP-Fluoreszenz) DAF-16::GFP-Lokalisierung. (b) Repräsentative Bilder des transgenen Stammes CF1407, gefüttert mit E. coli OP50 (links), W. koreensis (Mitte) und W. cibaria (rechts). Maßstabsbalken = 20 μm. (c) Kernlokalisierung von DAF-16 durch Weissella-Arten. Die angezeigten Werte sind der Mittelwert ± Standardabweichung von 90 Würmern für jede Bakterienart. Die gezeigten signifikanten Unterschiede beziehen sich auf E. coli OP50 (**p < 0,01, ***p < 0,001).

Um die Rolle der oben genannten Gene bei der Verlängerung der Lebensdauer zu bestätigen, wurden C. elegans-Mutanten mit Funktionsverlust für jedes dieser Gene mit Weissella oder E. coli OP50 gefüttert und ihre Langlebigkeit bewertet. Mit Weissella gefütterte mutierte Würmer mit Funktionsverlustmutationen in daf-16, aak-2 oder jnk-1 zeigten im Vergleich zur E. coli-Kontrollgruppe keine Verlängerung der Lebensdauer, was auf eine wesentliche Rolle dieser Gene bei der erhöhten Lebenserwartung schließen lässt von mit Weissella gefütterten Würmern (Tabelle 1, Abb. S5). Unerwarteterweise verlängerte sich die Lebensdauer der sod-3-, jkk-1-, skn-1-, hif-1- und daf-2-Mutanten immer noch, wenn sie mit Weissella gefüttert wurden. Die Feststellung, dass der Verlust von daf-2 keinen Einfluss auf die Verlängerung der Lebensspanne hat, legt nahe, dass der IIS-Signalweg nicht an der von Weissella abhängigen Verlängerung der Lebensspanne beteiligt ist. Zusammen mit den qRT-PCR-Ergebnissen legen diese obigen Ergebnisse nahe, dass Daf-16 der Schlüssel zur Förderung der Langlebigkeit bei mit Weissella gefütterten Würmern sein könnte.

Obwohl aus Kimchi isolierte W. koreensis und W. cibaria Kandidaten für Probiotika sein könnten, liegen für Weissella-Arten im Allgemeinen nur wenige Informationen vor, einschließlich der lebensdauerverlängernden Wirkung von Weissella auf C. elegans. Zuvor wurden Biomarker des Alterns wie Lipofuscin, Körpergröße und Bewegungsaktivität untersucht, um die Verlängerung der Lebenserwartung bei C. elegans abzuschätzen. Die Verfütterung von Weissella an C. elegans erhöhte den MLS signifikant und war negativ mit Biomarkern des Alterns verbunden. Die Verfütterung von Weissella an C. elegans reduzierte die Lipofuscin-Anreicherung, die Körpergröße, die Brutgröße und die Rachenpumprate. Darüber hinaus nahm die Bewegungsaktivität von C. elegans, die mit Weissella gefüttert wurden, langsamer ab als bei Würmern, die mit E. coli OP50 gefüttert wurden. Körperbewegungen können durch den Bewegungstest gemessen werden und die Ergebnisse der Bewegungsklasse geben Aufschluss über die verbleibende Lebensdauer von C. elegans nach einem Alter von 8 Tagen21. Lipofuscin (als Alterspigment bezeichnet) reichert sich in postmitotischen Zellen an und ist daher ein Marker für das Altern bei Tieren wie C. elegans22. Eine Verringerung der Körpergröße und der Pumpleistung hängt nicht nur mit dem Alter zusammen, sondern auch mit einer Ernährungseinschränkung, die die Lebensdauer durch eine Verringerung der Brutgröße verlängert23. Die inhärente Fähigkeit von Nematoden, Nachkommen zu produzieren, die Eiablageaktivität erwachsener Nematoden und die Überlebens- und Entwicklungsfähigkeit frisch geschlüpfter Nematoden können sich auf die Brutgröße auswirken. In diesem Experiment fraßen alle C. elegans im frühen Larvenstadium E. coli OP50 und daher konnte der Einfluss von Weissella auf die inhärente Fähigkeit von Nematoden, Nachkommen zu produzieren, ausgeschlossen werden. Während des Experiments gab es keine bemerkenswerten Unterschiede in der Anzahl toter Eier und Nachkommen, die sich nicht entwickelten, zwischen mit E. coli OP50 und Weissella gefütterten Würmern. Daher könnte Weissella hauptsächlich die Eiablageaktivität erwachsener Nematoden beeinträchtigen.

Darüber hinaus schränkt die Ernährungseinschränkung die ATP-Produktion bei C. elegans ein, und die ATP-Spiegel sanken bei mit Weissella gefütterten C. elegans im Vergleich zu mit E. coli OP50 gefütterten Würmern deutlich. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Weissella die Lebensdauer von C. elegans durch eine eingeschränkte Ernährung verlängern könnte. Dem Anziehungstest zufolge scheint C. elegans zunächst stärker von E. coli OP50 als von Weissella angezogen zu werden; Allerdings zeigte C. elegans nach etwa 60 Minuten keine Präferenz zwischen E. coli OP50 und Weissella. Diese Ergebnisse könnten mit der Tatsache zusammenhängen, dass C. elegans sein Verhalten und seine angeborenen chemosensorischen Vorlieben schnell ändern24. Dies bedeutet, dass eine Ernährungseinschränkung nicht mit einer Abstoßung von C. elegans gegenüber Weissella verbunden war.

Während die biologischen Auswirkungen von ROS auf Seneszenz und Antiseneszenz weiterhin umstritten sind25,26, wird allgemein angenommen, dass ROS (Nebenprodukte der Atmung) schädlich für biologische Prozesse sind. Es wurde jedoch berichtet, dass die ROS-Produktion Enzyme induziert, die Sauerstoffradikale entgiften, um ROS-Schäden abzuwehren27. In dieser Studie nahm die ROS-Produktion bei Würmern, die mit W. koreensis gefüttert wurden, deutlich ab, stieg jedoch bei Würmern, die mit W. cibaria gefüttert wurden, im Vergleich zu Kontrollen an. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass Weissella-Arten möglicherweise verschiedene Arten von ROS produzieren, die mehr oder weniger reaktiv gegenüber 2,7-Dichlorfluoresceindiacetat (DCF-DA) sind. Auch andere Mechanismen könnten die ROS-Ergebnisse beeinflusst haben; Beispielsweise könnten verschiedene Arten von Inhibitoren die ROS-Werte bei Würmern beeinflussen, die mit W. koreensis oder W. cibaria gefüttert wurden. Darüber hinaus könnten Unterschiede in den ROS-Werten zwischen W. koreensis und W. cibaria auf die Einschränkungen der Methoden mit DCF-DA28 zurückzuführen sein.

Bei C. elegans führten diätetische Einschränkungen zu einer geringen ROS-Produktion und einer längeren Lebensdauer29. Obwohl die Faktoren, die an der Erhöhung der ROS-Werte bei mit W. cibaria gefütterten C. elegans beteiligt sind, unbekannt bleiben, wurden mehrere positive Auswirkungen auf ROS und Langlebigkeit bei C. elegans berichtet. Erstens induziert ROS die Expression von Superoxiddismutase (SOD), die ROS entgiftet30,31. Zweitens fördern ROS die Expression von hif-1, das auch die Lebensdauer reguliert. Obwohl immer noch nicht klar ist, wie HIF-1 unter sauerstoffarmen Bedingungen aktiviert wird und welche nachgeschalteten Gene die Verlängerung der Lebensdauer ermöglichen, verlängert ein Anstieg der ROS-Werte die Lebensdauer von C. elegans durch die Stabilisierung von HIF-132. Drittens induzieren hohe ROS-Spiegel die Phosphorylierung und die anschließende Aktivierung von JNKs33, was auch in C. elegans auftreten kann. Es bleibt weiterhin umstritten, ob eine Ernährungseinschränkung die Lebensdauer verlängert, indem sie die ROS-Produktion reduziert oder die ROS-Abwehr und -Reparatur erhöht34. Ebenso stiegen bzw. sanken die ROS-Werte bei Würmern, die mit W. cibaria und W. koreensis gefüttert wurden, im Vergleich zu den Würmern, die mit E. coli OP50 gefüttert wurden. Die ROS-Produktion in C. elegans, die mit W. cibaria gefüttert wurde, stimmte nicht mit den Ergebnissen für Lipofuscin überein, einem komplexen Gemisch aus oxidierten und vernetzten Makromolekülen, einschließlich Proteinen, Lipiden und Kohlenhydraten. Die Lipofuscinspiegel bei Würmern, die mit beiden Weissella-Arten gefüttert wurden, waren deutlich niedriger als bei Würmern, die mit E. coli OP50 gefüttert wurden. Stoffwechsel- und Entgiftungsaktivitäten ändern sich mit dem Alter bei C. elegans35. Darüber hinaus wurden die ROS-Werte an 4-Tage-Würmern gemessen, die sich 24 Stunden lang von Weissella-Arten ernährten, während die Lipofuscin-Werte an 14-, 16- und 18-Tage-Würmern gemessen wurden, was möglicherweise die Inkonsistenz zwischen ROS-Wert und Lipofuscin verursacht hat Akkumulation in mit W. cibaria gefütterten C. elegans. Aus unseren Daten konnten wir daher nicht auf die Auswirkungen einer Ernährungseinschränkung auf die ROS-Werte schließen.

Die mit W. koreensis oder W. cibaria erzielten Ergebnisse unterschieden sich geringfügig. In dieser Studie hatte W. koreensis keinen Einfluss auf die hif-1-Genexpression. W. cibaria induzierte jedoch eine Überexpression von hif-1 und verlängerte dennoch die Lebensdauer von hif-1-Mutanten. DAF-16/FOXO könnte in hif-1-Mutanten aktiv relokalisiert werden; Es wurde gezeigt, dass HIF-1-Mutanten länger leben als Wildtyp-Würmer, da der Abbau von HIF-1 eine nukleare Relokalisierung von DAF-16/FOXO36 auslöst. Die Expression von sod-3 nahm in beiden Weissella-Gruppen zu, in der W. koreensis-Gruppe jedoch in geringerem Maße. Die Lebensdauer von sod-3-Mutanten, die mit W. koreensis und W. cibaria gefüttert wurden, war im Vergleich zu der von sod-3-Mutanten, die mit E. coli gefüttert wurden, verlängert. Die Ergebnisse legen nahe, dass SOD-3 für keine der Weissella-Arten ein wesentliches Ziel für die Verlängerung der Lebensdauer von C. elegans ist. Die Überexpression von sod-3 in den mit W. cibaria gefütterten Würmern könnte jedoch mit der Zunahme der ROS-Produktion in dieser Gruppe zusammenhängen.

Die Verlängerung der Lebenserwartung im Zusammenhang mit diätetischen Einschränkungen ist mit vielen Signalwegen verbunden, beispielsweise mit dem TOR-Signalweg, dem AMPK-Signalweg, dem IIS-Signalweg und Sirtuinen14. Unter diesen Signalwegen spielt DAF-16, der als Transkriptionsfaktor fungiert, eine wichtige Rolle bei der Verlängerung der Lebensspanne37, indem er die Langlebigkeit, den Fettstoffwechsel, die Stressreaktion, die Entgiftung freier Radikale und die Resistenz gegen Krankheitserreger reguliert. Unterdessen verlängert die Unterdrückung von DAF-2, das mit dem IIS-Signalweg zusammenhängt, die Lebensdauer, indem es DAF-1638 negativ reguliert. In dieser Studie stieg jedoch die Daf-16-Expression bei mit Weissella gefütterten C. elegans trotz erhöhter Daf-2-Expression. Daher hing die Verlängerung der Lebensdauer offenbar nicht mit dem IIS-Signalweg zusammen. Die stressbedingten Gene sod-3 und hif-1 können auch die Lebensdauer von C. elegans beeinflussen30,31. Die Gene jkk-1 und jnk-1 sind Mitglieder des JNK-Signalwegs39 und aak-2 aktiviert den AMPK-Signalweg16. Wir verwendeten Mutanten mit Funktionsverlust von C. elegans, um die relevanten Beiträge von Langlebigkeits-assoziierten Signalwegen zur Lebensdauer von C. elegans zu untersuchen. jnk-1- und aak-2-Mutanten wurden verwendet, um die Rolle der JNK- bzw. AMPK-Signalwege zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass mehrere altersbedingte Gene in mit Weissella gefütterten Würmern zunahmen und dass sowohl W. koreensis als auch W. cibaria die Lebensdauer in C. elegans daf-16-, aak-2- oder jnk-1-Mutanten nicht verlängerten, was darauf hindeutet, dass dies bei diesen Genen der Fall ist wesentlich für die Verlängerung der Lebensdauer von mit Weissella gefütterten C. elegans. JNK-1 und AAK-2 modulieren die DAF-16-Aktivität durch Phosphorylierung; Insbesondere ist die JNK-Familie, eine Untergruppe der MAPK-Superfamilie, Teil der Signaltransduktionskaskade, die durch die Einwirkung von Umweltstress und Zytokinen aktiviert wird40. In C. elegans interagiert JNK-1 direkt mit DAF-16, um die nukleare Translokation von DAF-16 zu vermitteln, was eine Hochregulierung mehrerer Stress- und Schadensreaktionsgene auslöst39. In ähnlicher Weise wurde kürzlich festgestellt, dass AAK-2, eine der beiden α-katalytischen Untereinheiten von AMPK, die Lebenserwartung von Würmern erhöht41. AMPK ist ein wichtiger Mediator der diätetischen Einschränkung der Lebenserwartung, der über DAF-16/FOXO16 wirkt und unabhängig vom IIS-Signalweg ist, da DAF-16 direkt durch AMPK16 phosphoryliert wird. Das aak-2-Gen kodiert für die energiearme AMPK und ist daher mit diätetischen Einschränkungen verbunden. AMPK/aak-2 ist notwendig, um eine Verlängerung der Lebensspanne durch eine Einschränkung der Ernährung herbeizuführen42. Die Lebensdauer der aak-2-Mutante von C. elegans wurde nicht verlängert und die Expression des aak-2-Gens nahm durch die Fütterung mit Weissella signifikant zu. Bei mit Weissella gefütterten C. elegans sanken die ATP-Spiegel signifikant, was mit der Aktivierung des AMPK-Signalwegs vereinbar ist. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Weissella-Arten die Langlebigkeit von C. elegans fördern, indem sie die Expression von daf-16 über die JNK- und AMPK-Wege erhöhen.

Der Mechanismus der Lebensverlängerung von mit Weissella gefütterten C. elegans unterschied sich von dem von Würmern, die mit B. infantis9 und L. rhamnosus10 gefüttert wurden. Basierend auf qRT-PCR- und Mutantenüberlebensdaten haben wir die Wege vorhergesagt, die an der Verlängerung der Lebensdauer von mit Weissella gefütterten C. elegans beteiligt sind (Abb. 7). Kurz gesagt, Weissella förderte die Langlebigkeit von C. elegans, indem es Ernährungseinschränkungen und Stressreaktionen und folglich die nachgeschaltete Expression von daf-16 über die AMPK- und JNK-Wege induzierte. Wir wissen nicht, ob Weissella im Vergleich zu E. coli OP50 kalorienärmer oder weniger nahrhaft ist. Interessanterweise nahm die Brutzeit bei mit Weissella gefütterten C. elegans zu, obwohl die Brutgröße abnahm. In dieser Studie durfte sich C. elegans frei von der Nahrungsquelle (E. coli OP50 oder Weissella) ernähren; Somit wurde die Ernährungseinschränkung nicht künstlich herbeigeführt. Die Ernährungseinschränkung bei C. elegans war nicht auf eine Abstoßung gegen Weissella zurückzuführen und stand nicht in Zusammenhang mit der von Weissella produzierten Milchsäure.

Es wird angenommen, dass ein Mechanismus an der Lebensdauerverlängerungswirkung von Weissella beteiligt ist.

JNK-1 und AAK-2 aktivieren DAF-16 über den JNK- bzw. AMPK-Weg. Aktiviertes DAF-16 beeinflusste sod-3, hif-1 und andere Gene, die mit der Langlebigkeit zusammenhängen. Der Insulin/IGF-1-Rezeptor DAF-2 hatte keinen Zusammenhang mit der Lebensverlängerung von C. elegans durch Weissella.

Metchnikoff stellte die Hypothese auf, dass Milchsäurebakterien für die menschliche Gesundheit und Langlebigkeit wichtig sind, und zwar auf der Grundlage der Langlebigkeit von Bulgaren, die viel Joghurt essen43. Es ist möglich, dass bei C. elegans ähnliche Mechanismen zur Verlängerung der Lebensdauer existieren. Darüber hinaus ist bekannt, dass eine eingeschränkte Ernährung bei einer Reihe verschiedener Arten, darunter Nagetiere, Würmer, Hefepilze und möglicherweise Primaten, die Lebenserwartung verlängert und altersbedingte Verschlechterungen der Gesundheit verzögert44. Es ist unklar, ob sich eine Ernährungseinschränkung auf andere Tiere in gleicher Weise auswirkt, aber es ist möglich, dass die in dieser Studie identifizierten Mechanismen auch auf andere Arten, einschließlich des Menschen, zutreffen. Schließlich stimulieren die JNK- und AMPK-Signalwege die Autophagie bei eingeschränkter Ernährung und daher sind weitere Studien zum möglichen Zusammenhang zwischen Autophagie und der Verlängerung der Lebensdauer von C. elegans durch Weissella erforderlich. Darüber hinaus wurde in der vorliegenden Studie eine Untergruppe von Genen untersucht, von denen bekannt ist, dass sie die Lebensdauer verlängern; Daher sind weitere Studien erforderlich, um das gesamte Genom von C. elegans zu untersuchen und andere mögliche Faktoren und/oder Wege aufzudecken, die zur Verlängerung der Lebensdauer von C. elegans durch Weissella beitragen.

W. koreensis KACC 11853 und W. cibaria KACC 11845 wurden von der Korean Agricultural Culture Collection (KACC) bezogen und als Testnahrungsquellen für Nematoden verwendet. E. coli OP50 wurde vom Caenorhabditis Genetics Center der University of Minnesota (CGC) bereitgestellt und als Kontrollnahrungsquelle verwendet. E. coli OP50 wurde in Luria-Bertani (LB)-Brühe (Difco, Detroit, MI, USA) 18–24 Stunden lang unter Schütteln bei 37 ° C gezüchtet. Weissella-Stämme wurden bei 30 °C für W. koreensis und 37 °C für W. cibaria in de Man, Rogosa und Sharpe (MRS)-Brühe (Difco) 24 Stunden lang ohne Schütteln gezüchtet. Die Bakterien wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 3.000 × g geerntet und in sterilem M9-Puffer gewaschen. Anschließend wurden die Bakterien in M9-Puffer8 auf eine Endkonzentration von 0,1 mg (Feuchtgewicht) pro Mikroliter eingestellt.

C. elegans Bristol-Stamm N2 (Wildtyp) und mutierte Stämme wurden vom CGC bereitgestellt. Für alle Messungen wurde der Bristol-Stamm N2 verwendet, mit Ausnahme des DAF-16-Lokalisierungstests und des Langlebigkeitstests mit den Mutantenstämmen. Die für Lebensdauermessungen verwendeten Mutanten waren CF1038 daf-16 (mu86), RB754 aak-2 (ok524), EU1 skn-1 (zu67), GA186 sod-3 (tm760), VC8 jnk-1 (gk7), ZG596 hif- 1 (ia7), CB1370 daf-2 (e1370) und KU2 jkk-1 (km2). CF1407 daf-16 (mu86) I; muIs 71 [pKL99(daf-16Ap::GFP::daf-16A(bKO)) + pRF4(rol-6)] wurde für den DAF-16-Lokalisierungstest verwendet. Nematoden wurden gemäß Standardtechniken bei 25 °C gehalten und vermehrt45. Die Bakteriensuspension wurde auf peptonfreiem modifiziertem Nematoden-Wachstumsmedium (mNGM) in Platten mit 90 mm Durchmesser verteilt, um die Würmer zu füttern. Um die Möglichkeit einer nematoziden Wirkung von Nährstoffen im Bakterienwachstumsmedium auszuschließen, wurde jedes Experiment auf mNGM-Platten durchgeführt9. Eier wurden von erwachsenen Würmern gewonnen, nachdem sie wie zuvor beschrieben einer Natriumhypochlorit-Natriumhydroxid-Lösung ausgesetzt worden waren46. Die Eisuspension in M9-Puffer wurde über Nacht bei 25 °C inkubiert, um das Schlüpfen der Eier zu ermöglichen, und die Suspension der Würmer im L1-Stadium wurde 2 Minuten lang bei 1.200 × g zentrifugiert. Nach dem Entfernen des Überstands wurden die verbleibenden Larven auf frische mNGM-Platten übertragen, die mit E. coli OP50 besät waren, und zwei Tage lang bei 25 °C inkubiert, um die Pubertät zu synchronisieren. Alle Experimente wurden mit 3 Tage alten Wildtyp-Würmern im jungen Erwachsenenalter (Tag 1 des Erwachsenenalters) durchgeführt (mit Ausnahme der Mutanten-Überlebenstests).

Für den Langlebigkeitstest wurden mNGM/FUdR-Platten durch Ergänzung mit 5-Fluor-2′-desoxyuridin (FUdR, Sigma Aldrich) (50 μM)47 hergestellt. E. coli OP50-, W. koreensis- und W. cibaria-Zellen in M9-Puffer (20 mg Nassgewicht) wurden auf mNGM/FUdR-Platten (90 mm Durchmesser) verteilt. Der Langlebigkeitstest wurde im L4-Stadium von N2-Nematoden und -Mutanten begonnen, wonach die Würmer auf Platten mit einem Platindraht übertragen wurden. Für jeden Test wurden 30 Würmer auf drei Platten (10 Würmer pro Platte) für jede Bakterienart getestet. Die Platten wurden bei 25 °C inkubiert und alle 24 Stunden wurden lebende und tote Würmer gezählt. Ein Wurm galt als tot, wenn er nicht auf eine sanfte Berührung mit einem Platindrahtpicker reagierte. Würmer, die einen abnormalen Tod zeigten, wie z. B. geschlüpfte Nachkommen im Körper, eine Explosion der Vulva oder Tod durch Anhaften an der Plattenwand, wurden von der Lebensdaueranalyse ausgeschlossen. Während des Tests wurden die getesteten Würmer in den ersten drei Tagen täglich auf frische mNGM-Platten übertragen und für den Rest des Experiments einmal pro Woche, um eine ausreichende Nahrungsquelle aufrechtzuerhalten. Der Langlebigkeitstest wurde mindestens dreimal unabhängig voneinander durchgeführt. Die mittlere Lebensdauer wurde mithilfe von Gl. geschätzt. (1)48:

Dabei ist j das Alter (Tag), dj die Anzahl der Würmer, die im Altersintervall (xj, x j+1) gestorben sind, und N die Gesamtzahl der Würmer. Der Standardfehler (SE) der geschätzten mittleren Lebensdauer (MLS) wurde mithilfe von Gl. berechnet. (2):

Die gesamten ROS-Werte wurden in ganzen Würmern unter Verwendung von 2,7-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (H2-DCF-DA) (Sigma-Aldrich) quantifiziert. Die ROS-Werte wurden gemäß zuvor durchgeführten Protokollen mit geringfügigen Änderungen bestimmt49. Kurz gesagt, Würmer wurden 24 Stunden lang mit jedem Bakterienrasen gefüttert und mit M9-Puffer gesammelt. Die Bakterien wurden durch dreimaliges Waschen mit M9-Puffer entfernt und die Würmer wurden in M9-Puffer resuspendiert. Um eine Überschätzung der ROS-Werte zu vermeiden, wurden ganze Würmer verwendet50. Ein 50-μl-Aliquot der Suspension wurde in jede Vertiefung einer schwarzen 96-Well-Platte überführt und ein 50-μl-Aliquot der frisch zubereiteten 100 μM H2-DCF-DA-Lösung hinzugefügt, was zu einer Endkonzentration von 50 μM führte. Pro Probe wurden vier Vertiefungen verwendet. Von jedem Bakterienrasen gab es Kontrollvertiefungen mit Nematoden ohne H2-DCF-DA und mit H2-DCF-DA ohne Nematoden. Nach der Zugabe von H2-DCF-DA wurde das Grundfluoreszenzsignal jeder Vertiefung sofort mit einem Fluoreszenz-Mikroplattenlesegerät (SpectraMAX GEMINI EM, Molecular Devices) bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 485 nm bzw. 520 nm gemessen. Nach der ersten Ablesung wurde die Platte 1 Stunde lang bei 25 °C inkubiert und die Fluoreszenzintensität bei derselben Wellenlänge gemessen. Die Änderung der Fluoreszenz wurde durch Subtrahieren des Anfangswerts vom Endwert für jede Vertiefung, einschließlich der Kontrollvertiefungen, bestimmt. Ein Milliliter der anfänglichen Wurmsuspension jeder Probe wurde zur Proteinquantifizierung verwendet, um das Fluoreszenzsignal zu normalisieren. Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt.

Die Autofluoreszenz von intestinalem Lipofuscin wurde als Seneszenzindex zwischen dem 10. und 18. Tag des Erwachsenenalters gemessen. Zufällig ausgewählte Würmer aus der mit E. coli OP50 oder Weissella-Arten bewachsenen Platte wurden dreimal mit M9-Puffer gewaschen. Anschließend wurden die Würmer auf ein 5 %iges Agarkissen gelegt, das mit 10 mM Natriumazid (Junsei Chemical, Tokio, Japan) in M9-Puffer beschichtet war, um eine Anästhesie einzuleiten. Lipofuscin-Autofluoreszenzbilder wurden unter Verwendung von blauem Anregungslicht (405–488 nm), einem DAPI-Kanal (4′,6-Diamidino-2-phenylindol) eines konfokalen Laser-Rastermikroskops (Olympus Ix81-FV1000, Japan) aufgenommen. Die Fluoreszenz wurde an den Tagen 14, 16 und 18 mit der ImageJ-Software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) quantifiziert, um die Lipofuscinspiegel zu bestimmen. An jedem Tag wurden drei unabhängige Experimente mit über 30 Würmern für jede Bakterienart durchgeführt.

Die Bewegungsaktivität von Würmern unterschiedlichen Alters wurde mithilfe einer in früheren Berichten beschriebenen Bewertungsmethode untersucht21,52. Würmer wurden in die Klasse „A“ eingestuft, wenn sie als Reaktion auf das Anstupsen spontane Bewegungen oder kräftige Fortbewegung zeigten; Würmer der Klasse „B“ bewegten sich nicht, es sei denn, sie wurden angestoßen, oder sie schienen sich unkoordiniert zu bewegen; Würmer der Klasse „C“ bewegten als Reaktion auf das Anstupsen nur ihren Kopf und/oder ihren Schwanz; Würmer der Klasse „D“ waren tot. Die Experimente wurden dreimal unabhängig voneinander wiederholt und für jede Bakterienart wurden mindestens 100 Würmer bewertet.

Drei Tage alte erwachsene Würmer (L4-Stadium) wurden auf mNGM-Platten (60 mm Durchmesser) übertragen, die mit 5 mg (Feuchtgewicht) Weissella- oder E. coli OP50-Zellen in M9-Puffer bedeckt waren. Die Platten wurden bei 25 °C inkubiert und die Körpergröße lebender Würmer bis zum Alter von 7 Tagen alle 24 Stunden gemessen. Fünf Würmer pro Bakterienart wurden unter Verwendung von fünf Platten untersucht (ein Wurm pro Platte). Bilder von Würmern wurden mit einem Stereomikroskop (Olympus SZ61) und einer ToupCam (UCMOS05100KPA) aufgenommen. Die Bilder wurden mit der ImageJ-Software analysiert. In diesem System wurde die Projektionsfläche eines Wurms automatisch geschätzt und als Indikator für die Körpergröße verwendet7. Es wurden drei unabhängige Experimente mit 20 Würmern für jede Bakterienart durchgeführt.

Würmer im L4-Stadium wurden auf mNGM-Platten übertragen, die mit Weissella oder E. coli OP50 beschichtet waren, und bei 25 °C inkubiert. Die Elterntiere wurden bis zum Ende der Fortpflanzungsperiode täglich auf frische mNGM-Platten (60 mm Durchmesser) übertragen. Die Nachkommen jedes Tieres wurden im L2- oder L3-Stadium gezählt. Zehn Würmer pro Bakterienart wurden unter Verwendung von fünf Platten (zwei Würmer pro Platte) getestet und der Test wurde dreimal durchgeführt9.

Pumptests wurden auf mNGM-Platten mit Bakterienrasen bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach 30 Minuten wurden Würmer im L4-Stadium (3 Tage alt) auf mit Bakterien besiedelte mNGM-Platten übertragen und die Anzahl der Kontraktionen im Endbulbus des Pharynx wurde 1 Minute lang unter Verwendung eines inversen Olympus CKX41-Mikroskops (×400) gezählt. Die Würmer wurden bei 25 °C inkubiert und die Pumprate der Würmer auf jedem Bakterienrasen wurde alle 24 Stunden8 gemessen. An jedem Tag wurden drei unabhängige Experimente mit jeweils 20 Würmern für jede Bakterienart durchgeführt.

Vier Tage alte erwachsene Würmer, die 24 Stunden lang mit jedem Bakterienrasen gefüttert wurden, wurden gesammelt und dreimal in M9-Puffer gewaschen. Wurmpellets wurden mit drei Einfrier-/Auftauzyklen behandelt und 15 Minuten lang gekocht, um ATP freizusetzen und die ATPase-Aktivität zu zerstören. Danach wurden die Würmer 10 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 × g zentrifugiert und die ATP-Werte mit dem ATPlite-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (PerkinElmer, USA) quantifiziert. Die Lumineszenz wurde mit einem Fluoreszenz-Mikroplattenlesegerät (Molecular Devices, SpectraMAX GEMINI EM) gemessen. Die lösliche Proteinkonzentration des gleichen Präparats wurde mit dem Bradford-Assay gemessen und der ATP-Gehaltswert wurde gegen den Proteingehalt normalisiert53. Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt.

Um die chemotaktische Aktivität von Würmern gegenüber Weissella, 95 % Ethanol (Samchun-Chemikalie, Korea), Milchsäure (Samchun-Chemikalie) und M9-Puffer zu untersuchen, haben wir einen Chemotaxis-Assay mit geringfügiger Modifikation der Methoden von Bargmann54 und Beale55 entwickelt. Bakteriennahrung oder anderes Material wurde auf die Mitte der mNGM-Platten mit 90 mm Durchmesser getupft (Abb. S3) und über 1.000 Würmer wurden 10 mm von den Seiten der Platten entfernt platziert. Nach 30-minütiger und 60-minütiger Inkubation bei 25 °C wurde die Anzahl der Würmer im 30-mm-Durchmesserkreis in der Mitte jeder Platte, einschließlich jedes Bakterienrasens, gezählt. Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt.

Würmer, die 24 Stunden lang mit E. coli OP50 oder Weissella gefüttert wurden, wurden in M9-Puffer gesammelt und die Gesamt-RNA wurde wie zuvor berichtet aus ganzen Würmern isoliert56. Die Gesamt-RNA wurde mit dem RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (Thermo Scientific) in cDNA umgewandelt, gefolgt von quantitativer RT-PCR (qRT-PCR) mit SYBR Green (KAPA Biosystems, USA) und StepOnePlus Echtzeit PCR-System (Applied Biosystems). Primer wurden mit der Primer 3-Software entworfen57. Die Primersequenzen sind in Tabelle S3 aufgeführt. Die Reaktionen wurden bei 95 °C eingeleitet, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 20 s, 56 °C für 20 s und 72 °C für 30 s, gefolgt von einer Schmelzkurvenanalyse. Die relativen Expressionsniveaus wurden mit der 2−ΔΔCT-Methode berechnet58. Das Kontrollgen act-2 wurde zur Normalisierung der Genexpressionsdaten59 verwendet. Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt.

Der transgene Stamm CF1407 daf-16 (mu86) I; muIs 71 [pKL99(daf-16Ap::GFP::daf-16A(bKO)) + pRF4(rol-6)] wurde verwendet, um die intrazelluläre Lokalisierung des GFP-markierten DAF-16-Proteins nachzuweisen. Zufällig ausgewählte 4 Tage alte Würmer, die 24 Stunden lang auf mit E. coli OP50 oder Weissella-Arten bewachsenen Platten gefüttert wurden, wurden dreimal mit M9-Puffer gewaschen. Anschließend wurden die Würmer auf 5 % Agar-Pads gelegt, die mit 10 mM Natriumazid (Junsei Chemical, Tokio, Japan) in M9-Puffer beschichtet waren, um eine Anästhesie einzuleiten. GFP-Bilder wurden mit grünem Anregungslicht (460–495 nm), einem GFP-Kanal (grünes Fluoreszenzprotein), eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops (Olympus Ix81-FV1000, Japan) aufgenommen. Die Lokalisierung von DAF-16-GFP aus dem Zytoplasma in den Zellkernen wurde durch Analyse des Ausmaßes der nuklearen GFP-Fluoreszenz untersucht. Es können leicht drei verschiedene Zustände unterschieden werden (keine, schwache oder starke nukleare GFP-Fluoreszenz), die mit einer zytoplasmatischen, intermediären oder nuklearen Lokalisierung von DAF-16-GFP60 zusammenhängen. Der Grad der nuklearen Translokation von DAF-16 wurde durch Zählen der Anzahl der Würmer ermittelt, die entweder eine schwache oder starke nukleare GFP-Fluoreszenz zeigten. Für jede Bakterienart wurden drei unabhängige Experimente mit über 90 Würmern durchgeführt.

Die Überlebensrate der Nematoden wurde mit der Kaplan-Meier-Methode berechnet und die Signifikanz der Überlebensunterschiede wurde mit dem Log-Rank-Test8 getestet. Unterschiede in den Lipofuscinspiegeln wurden mithilfe des Mann-Whitney-U-Tests9 bewertet. Eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Post-hoc-Tukey-Test wurde verwendet, um die Wirkung von Weissella auf die Rachenpumpraten zu vergleichen, und ANOVA mit Duncan-Test wurde verwendet, um die Chemotaxis gegenüber verschiedenen Nahrungsquellen zu vergleichen. Ergebnisse wurden als signifikant angesehen, wenn p < 0,05. In anderen Experimenten wurden die Mittelwerte der E. coli OP50- und Weissella-Gruppenwerte mithilfe des Student-t-Tests bestimmt. P-Werte ≤ 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen und Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung.

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Abteilung für öffentliche Gesundheitswissenschaften (Brain Korea 21 PLUS-Programm), Graduiertenschule, Korea University, Seoul, 136-701, Republik Korea

Jiyun Lee, Gayeung Kwon & Young-Hee Lim

School of Biosystem and Biomedical Science, College of Health Science, Korea University, Seoul, Republik Korea

Young-Hee Lim

Abteilung für Labormedizin, Korea University Guro Hospital, Seoul, Republik Korea

Young-Hee Lim

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YHL und JL konzipierten die Forschung und JL, GK und YHL führten die Experimente durch. YHL und JL haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lee, J., Kwon, G. & Lim, YH. Aufklärung des Mechanismus der Weissella-abhängigen Lebensverlängerung bei Caenorhabditis elegans. Sci Rep 5, 17128 (2015). https://doi.org/10.1038/srep17128

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Eingegangen: 14. Juli 2015

Angenommen: 26. Oktober 2015

Veröffentlicht: 25. November 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep17128

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