Ein Lignan aus Alnus japonica hemmt Glioblastom-Tumorsphären durch Unterdrückung von FOXM1

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 13990 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Es ist bekannt, dass Forkhead Box M1 (FOXM1) die Zellproliferation, Apoptose und Tumorentstehung reguliert. Das Lignan (−)-(2R,3R)-1,4-O-diferuloylsecoisolariciresinol (DFS) aus Alnus japonica hat durch die Unterdrückung von FOXM1 eine krebshemmende Wirkung gegen Darmkrebszellen gezeigt. In der vorliegenden Studie wurde die Hypothese aufgestellt, dass DFS eine krebshemmende Wirkung gegen Glioblastom (GBM)-Tumorsphären (TS) haben kann. Immunpräzipitations- und Luciferase-Reporter-Assays wurden durchgeführt, um die Fähigkeit von DFS zu bewerten, die nukleare Translokation von β-Catenin durch β-Catenin/FOXM1-Bindung zu unterdrücken. Mit DFS vorbehandelte GBM-TS wurden bewertet, um die Fähigkeit von DFS zur Hemmung von GBM-TS und deren Transkriptionsprofilen zu beurteilen. Die In-vivo-Wirksamkeit wurde in orthotopen Xenotransplantatmodellen von GBM untersucht. Die Expression von FOXM1 war in GBM höher als in normalen Geweben. Der durch DFS induzierte Abbau des FOXM1-Proteins blockierte die Translokation von β-Catenin in den Zellkern und unterdrückte folglich stromabwärts gelegene Zielgene der FOXM1-Signalwege. DFS hemmte die Lebensfähigkeit der Zellen und die ATP-Spiegel, während es die Apoptose erhöhte, und es reduzierte die Bildung von Tumorkügelchen und die Invasivität von GBM-TSs. Und DFS reduzierte die Aktivitäten von Transkriptionsfaktoren im Zusammenhang mit Tumorentstehung, Stammzellenbildung und Invasivität. DFS hemmte das Tumorwachstum signifikant und verlängerte die Überlebensrate von Mäusen in orthotopen Xenotransplantatmodellen von GBM. Dies legt nahe, dass DFS die Proliferation von GBM-TS hemmt, indem es FOXM1 unterdrückt. DFS könnte ein potenzielles therapeutisches Mittel zur Behandlung von GBM sein.

Das Glioblastom (GBM), der häufigste primäre bösartige Tumor im Gehirn, ist äußerst aggressiv1. Trotz intensiver Behandlung mit Operation, Chemotherapie und Strahlentherapie haben Patienten mit GBM eine hohe Sterblichkeitsrate und eine schlechte Prognose1,2,3. Darüber hinaus ist bis heute relativ wenig über die Zellen bekannt, aus denen GBM entsteht, oder über die genetischen Mutationen, die mit der GBM-Tumorentstehung einhergehen, sodass GBM immer noch eine schwer zu bekämpfende Krankheit bleibt4,5. Frühere Studien berichteten jedoch, dass die GBM-Tumorsphäre (TS), die durch GBM-residente Zellen in Kultur gekennzeichnet ist, behandlungsresistente Eigenschaften sowie ein Stammprofil und die Fähigkeit zur Bildung von Tumoren aufweist und sich nachweislich für die klinische Anwendung als wertvoll erweist6. 7.

Forkhead Box M1 (FOXM1) ist ein Mitglied der Familie der Forkhead-Box-Transkriptionsfaktoren, die nachweislich die Reparatur von DNA-Schäden, die Zellproliferation, Apoptose, Angiogenese und Tumorentstehung regulieren8. Die Expression von FOXM1 ist in vielen menschlichen Tumoren deutlich erhöht, darunter nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Brustkrebs, Basalzellkarzinom, hepatozelluläres Karzinom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Dickdarmkrebs, Medulloblastom und GBM9,10,11,12,13. Eine hohe Expression von FOXM1 in Gliomzellen steigert die Tumorentstehung, Invasivität und Angiogenese in GBM-Tiermodellen14,15,16. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass FOXM1 den Wnt/β-Catenin-Signalweg reguliert, indem es die nukleare Translokation von β-Catenin fördert 17,18.

Alnus japonica (Betulaceae) ist eine Pflanze, die in Ostasien als Heilkraut verwendet wird. Diese Pflanze enthält pharmakologisch aktive Verbindungen, darunter das isolierte Lignan (−)-(2R,3R)-1,4-O-diferuloylsecoisolariciresinol (DFS), von dem festgestellt wurde, dass es die Lebensfähigkeit von Dickdarmkrebszellen verringert und den Zellzyklus unterbricht . Wir haben zuvor berichtet, dass DFS die β-Catenin-Translokation in den Zellkern stört und anschließend die Expressionsniveaus von β-Catenin-vermittelten Genen durch Unterdrückung der FOXM1-Proteinexpression bei Dickdarmkrebs verringert19. DFS induzierte auch Autophagie und endoplasmatischen Retikulum (ER)-Stress in Prostata- und Dickdarmkrebszellen20. FOXM1/β-Catenin-Wechselwirkungen können auch die Stammzellenbildung und Tumorigenität von Gliomstammzellen regulieren18. Da GBM-TS gegen herkömmliche Behandlungen wie Strahlentherapie und Chemotherapie resistent sind, gelten sie als gute Plattform zum Testen der therapeutischen Wirksamkeit von Arzneimittelkandidaten. Wir haben versucht, aus Heilpflanzen wie A. japonica vielversprechende Anti-GBM-Wirkstoffe zu finden. Über die Auswirkungen des DFS auf GBM-TS ist jedoch relativ wenig bekannt.

In der vorliegenden Studie wurde die Hypothese aufgestellt, dass DFS die Translokation von β-Catenin in den Zellkern blockieren kann, indem es die Bildung des FOXM1/β-Catenin-Komplexes in GBM-TS unterdrückt. Darüber hinaus wurde das krebshemmende Potenzial von DFS gegen GBM mithilfe von GBM-TSs und einem orthotopischen Xenotransplantat-Mausmodell bewertet.

GBM-Gewebeproben wurden von 49 Patienten entnommen, die sich von Mai 2009 bis Dezember 2016 einer GBM-Operation unterzogen hatten, und von 49 Patienten wurden auch 8 normale Hirngewebeproben entnommen. Alle Proben stammten von Patienten, bei denen erstmals GBM diagnostiziert wurde, und Gewebe von Patienten mit erneutem GBM wurden ausgeschlossen.

Ähnlich wie in früheren Berichten21,22 waren die Expressionsniveaus von FOXM1- und β-Catenin (CTNNB1)-mRNAs in 49 GBM-Geweben signifikant höher als in 8 normalen Geweben, und öffentliche Datensätze, Oncopression und REMBRANDT, zeigten ähnliche Ergebnisse von FOXM1 und β-Catenin (CTNNB1)-Expressionsniveau (Abb. 1A, B).

Expression von FOXM1- und β-Catenin-mRNAs und -Proteinen in GBM-Geweben und hemmende Wirkung von DFS auf das Zellüberleben. (A,B) Expressionsniveaus von (A) FOXM1- und (B) β-Catenin (CTNNB1)-mRNAs und Vergleich mit öffentlichen Datensätzen. 865 GBM-Gewebe und 723 normale Hirngewebe im Datensatz von Oncopression, während 228 GBM-Gewebe und 28 normale Hirngewebe im Datensatz von REMBRANDT enthalten sind. (C) Zelllebensfähigkeit und (D) ATP-Spiegel gemessen nach 72 h Behandlung mit den angegebenen DFS-Konzentrationen. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD (n = 5) ausgedrückt. (E,F) GBM TSs wurden 72 Stunden lang mit DFS behandelt und (E) Zellzyklusfraktionen und (F) apoptotische Zellpopulationen durch FACS analysiert. (G) Expression von Apoptose-assoziierten Proteinen, gemessen durch Western Blot nach 72-stündiger Behandlung mit DFS. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch eine einfache ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test für mehrere Vergleiche verglichen; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Um den Wirkungsmechanismus von DFS gegen GBM-TS zu beurteilen, haben wir die Auswirkungen von DFS auf die Lebensfähigkeit der Zellen und die ATP-Spiegel untersucht. WST-Assays bestätigten, dass DFS die Lebensfähigkeit der Zellen in GBM-TS dosisabhängig verringerte (Abb. 1C) und die ATP-Spiegel konzentrationsabhängig senkte (Abb. 1D). Basierend auf diesen Ergebnissen wurden DFS-Konzentrationen von 5 µM und 10 µM für weitere Studien ausgewählt. Die DFS-Behandlung erhöhte den Prozentsatz der GBM-TS in Sub-G1-Phasen signifikant (mehr als 55 %) im Vergleich zur Kontrolle (etwa 10 %) (Abb. 1E) und erhöhte den Prozentsatz der Zellen in frühen Stadien der Apoptose deutlich (Abb . 1F). DFS veränderte auch die Konzentrationen apoptotischer Marker wie Bcl-2, BAX und gespaltener Caspase-3, was darauf hinweist, dass DFS Zellapoptose induzierte (Abb. 1G). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass DFS die Zellproliferation verringert und gleichzeitig den Zelltod von GBM-TSs bei einer Dosis von mehr als 5 µM induziert.

Stammzellen und Invasivität sind entscheidende Aspekte neuronaler Stammzellen. Wir haben daher die Auswirkungen von DFS auf den Stamm und die Invasivität von GBM-TS gemessen. Kugelbildungsassays bewerten die Stammhaftigkeit von GBM-TSs, ein wesentliches Merkmal für die Selbsterneuerung, Proliferation und Multipotenz von Zellen. Die 3-wöchige Behandlung von GBM-TSs mit 10 µM DFS reduzierte den Prozentsatz kugelpositiver Vertiefungen und Kugelradien deutlich (Abb. 2A) und reduzierte außerdem die Expressionsniveaus von stammbezogenen Markerproteinen, einschließlich CD133, Nestin und Sox2 , CD44, Msi-1 und PDPN (Abb. 2B). Die Behandlung mit 10 µM DFS hemmte auch deutlich die invasive Kapazität von GBM-TSs, wie durch 3D-Matrigel-Invasionstests bestimmt wurde (Abb. 2C), und reduzierte deutlich die Expression von mit der Invasivität verbundenen Markerproteinen, einschließlich Zeb1, N-Cadherin und Snail und Twist (Abb. 2D). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass DFS die Stammwirkung und Invasivität patienteneigener GBM-TS signifikant unterdrückte.

Hemmende Wirkung von DFS auf Stammzellen und Invasivität von GBM-TS. (A) Die Stammform wurde durch den Kugelbildungstest bestimmt. Die Zellen wurden 3 Wochen lang mit DFS behandelt und die Prozentsätze der kugelpositiven Vertiefungen und Kugelradien wurden berechnet. (B) GBM TSs wurden 72 Stunden lang mit DFS behandelt und die stammassoziierten Proteinspiegel wurden durch Western Blot bestimmt. (C) GBM-TSs wurden 72 Stunden lang auf Matrigel/Kollagen-Matrix mit DFS kultiviert, und die Invasivität wurde durch Messung der Migrationsbereiche quantifiziert. (D) Western-Blot-Assays der Expression von EMT-bezogenen Proteinen. Alle Bilder haben eine 10-fache Originalvergrößerung (Maßstabsbalken = 200 μm). Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch eine einfache ANOVA mit dem Post-hoc-Test von Tukey verglichen; bedeutet ± SD; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, zwischen den angegebenen Gruppen oder im Vergleich mit Kontrollen.

Vor der Untersuchung der hemmenden Wirkung von DFS auf die Kerntranslokation von β-Catenin wurden die Markerproteine im Zytosol und Kern mithilfe von PARP und β-Tubulin identifiziert, um die nukleozytoplasmatische Trennung zu bestätigen. Infolgedessen PARP-positiv/β-Tubulin-negativ im Zellkern; PARP-negativ/β-Tubulin-positiv im Zytosol wurden identifiziert und daher die Kern-/Zytosolfraktion validiert.

Um die hemmende Wirkung von DFS auf FOXM1/β-Catenin-Wechselwirkungen zu testen, wurden Proteine, die von Genen im Zusammenhang mit dem β-Catenin-Signalweg kodiert werden, durch Western Blot quantifiziert. DFS reduzierte die Spiegel von FOXM1, aktivem β-Catenin und der gesamten β-Catenin-Expression im Ganzzelllysat von GBM-TSs (Abb. 3A) bei 10 µM signifikant. IP-Analysen zeigten, dass DFS die Wechselwirkung zwischen FOXM1 und β-Catenin in GBM-TSs unterdrückte (Abb. 3B). Wir haben weiter geklärt, ob es sich bei der Interaktion zwischen β-Catenin und FOXM1 um eine direkte Interaktion handelt, indem wir eine Reihe von GST-Pulldown-Assays unter Verwendung von gereinigtem, bakteriell produziertem GST-β-Catenin und Flag-markiertem FOXM1-Lysat aus TS15-88 und TS13-64 durchgeführt haben. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Bindung von β-Catenin und FOXM1 dosisabhängig nach der Behandlung von DFS in einer Konzentration von 5 und 10 μM abnimmt (Abb. 3C). Eine Oberflächenplasmonresonanzanalyse (SPR) wurde durchgeführt, um die Bindungsaffinität von β-Catenin und FOXM1 durch DFS zu bestätigen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass das rekombinante humane β-Catenin-Protein FOXM1 in dosisabhängiger Weise durch Behandlung mit DFS-Konzentrationen von 12,5 bis 50 μM band (Ergänzung 1). Immunfluoreszenz (IF) und subzelluläre Fraktion zeigten, dass die Gesamtexpression von FOXM1 und β-Catenin verringert war und der größte Teil von β-Catenin durch DFS im Zytosol und weniger im Zellkern exprimiert wurde (Abb. 3D, E). Wir haben auch quantitativ bestätigt, dass DFS die Fluoreszenzintensität von FOXM1 und b-Catenin verringerte (Ergänzung 2a) und dass die nukleäre Expression von b-Catenin im Vergleich zur Kontrollgruppe eher verringert war als die zytosolische Expression (Ergänzung 2b). Darüber hinaus reduzierte DFS die TCF/LEF-Signalaktivität in GBM-TSs in dosisabhängiger Weise deutlich (Abb. 3F) und reduzierte die Expression von Cyclin D1 und cMyc, die durch FOXM1/β-Catenin reguliert werden und einen Komplex bilden mit dem TCF/LEF-Transkriptionsfaktor (Abb. 3G). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass DFS die Bindung von FOXM1 und β-Catenin hemmte und dadurch die Bildung von Komplexen mit TCF/LEF und Unterschritten hemmte. In Kontroll- und DFS-behandelten GBM-TSs verwendeten wir Cycloheximid zur Hemmung der Proteinsynthese und untersuchten die Stabilität des FOXM1-Proteins. Unsere Ergebnisse zeigten, dass bei Kombination von CHX und DFS der Proteingehalt von FOXM1 viel stärker abnahm als bei alleiniger Verwendung von CHX, was darauf hindeutet, dass DFS die Lebensdauer des FOXM1-Proteins verkürzte und die Proteinstabilität verringerte (Ergänzung 3). Somit verringert DFS die Stabilität des FOXM1-Proteins, indem es den Proteinabbau induziert. Eine schematische Abbildung, die den gesamten Prozess dieses Experiments zusammenfasst, ist in Ergänzung 4 beschrieben.

Hemmung der FOXM1/β-Catenin-Interaktion durch DFS. (A) GBM TSs wurden 72 Stunden lang mit DFS behandelt und die Proteinspiegel von FOXM1, aktivem β-Catenin und Gesamt-β-Catenin wurden durch Western Blot bestimmt. (B) DFS-behandelte GBM-TSs wurden mit Anti-FOXM1- und β-Catenin-Antikörpern immunpräzipitiert und die endogene Expression von FOXM1- und β-Catenin-Proteinen wurde durch Western Blot bestimmt, um die Wechselwirkungen zwischen ihnen zu bestimmen. (C) GST-Pulldown-Assay zur Bestätigung, ob FOXM1- und β-Catenin-Wechselwirkungen direkt oder indirekt sind. (D) Immunfluoreszenz zur Bestimmung, ob DFS die nukleare Translokation von β-Catenin beeinflusst (Vergrößerung × 20). (E) Spiegel von FOXM1- und β-Catenin-Proteinen in den zytosolischen und nuklearen Fraktionen von GBM-TSs, bestimmt durch Western Blot. Die zytosolischen und nuklearen Fraktionen werden mit C bzw. N bezeichnet. Zytosolischer Marker: β-Tubulin; Nuklearmarker: PARP. (F) Messungen der β-Catenin/TCF-Signalaktivität in GBM-TSs, die mit dem TOPflash- oder FOPflash-Luciferase-Vektor transfiziert wurden. (G) Expression von Proteinen, die von β-Catenin-Downstream-Genen (Cyclin D1, cMYC) kodiert werden, gemessen durch Western Blot. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch eine einfache ANOVA mit dem Post-hoc-Test von Tukey verglichen; bedeutet ± SD; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, zwischen den angegebenen Gruppen oder im Vergleich mit Kontrollen.

Eine RNA-Sequenzierung wurde durchgeführt, um die Auswirkungen der DFS-Behandlung auf die transkriptionelle Neuprogrammierung von GBM-TSs zu bewerten. Bei der RNA-Sequenzierung verwendete GBM-TS wurden 72 Stunden lang mit 10 µM DFS behandelt, und die experimentellen Ergebnisse zeigten keinen Unterschied in der Wirkung von DFS zwischen den beiden GBM-TS TS13-64 und TS15-88. Die Proben wurden einer Einzelproben-Gensatz-Anreicherungsanalyse (ssGSEA) unter Verwendung von Transkriptionsfaktor-Zielgensätzen unterzogen23. DFS reduzierte die Aktivitäten mehrerer Transkriptionsfaktoren, die mit Tumorentstehung, Stammzellenbildung, Invasivität und mesenchymalem Übergang verbunden sind, erheblich, während es gleichzeitig die Aktivitäten von Tumorsuppressor-Transkriptionsfaktoren signifikant erhöhte (Abb. 4A). Und DFS reduzierte das Expressionsniveau von mRNAs, die mit den FOXM1-Zielgenen assoziiert sind (Abb. 4B). Außerdem wurden die Expressionsniveaus von mRNAs, die mit dem Wnt-Signalweg und der Aktivierung von β-Catenin/TCF-Komplex-assoziierten Genen (Abb. 4C) sowie von Stammzellen- und Invasivitäts-bezogenen Genen (Abb. 4D) assoziiert sind, konsequent herunterreguliert ). Die Analyse differentiell exprimierter Gene (DEGs) durch DFS-behandelte und Kontroll-GBM-TSs zeigte, dass die in DFS-behandelten Zellen signifikant herunterregulierten DEGs mehrere Zellzyklus-assoziierte Gensätze umfassten (Abb. 4E), und wir bestätigten auch, dass die Expression der meisten Gene an Sub-G1-, S- und G2-Phasenübergängen beteiligt waren, wurden herunterreguliert (Abb. 4F). Aufgrund dieser Ergebnisse geht man davon aus, dass DFS einen Zellzyklusstopp induziert.

Auswirkungen von DFS auf das Transkriptionsprofil, bestimmt durch RNA-Sequenzierung. (A) Onkogene und Tumorsuppressor-Transkriptionsfaktoren, gemessen durch Single Gene Set Enrichment Analysis (ssGSEA). (B) Expression von Zielgenen von FOXM1, bewertet durch RNA-Sequenzierung. (C) Expression von Wnt-Signalgenen und β-Catenin/TCF-Komplex-bezogenen Genen, bewertet durch RNA-Sequenzierung. (D) Wärmekarte, die die Expressionsniveaus von Stammzellen- und Invasivitäts-assoziierten Genen zeigt. (E) Satz von Genen, die nach 72-stündiger Behandlung mit DFS herunterreguliert wurden. (F) Wärmekarte, die die Expressionsniveaus zellzyklusbezogener Gene zeigt.

Die Auswirkungen der DFS-Vorbehandlung von GBM-TSs auf das Tumorwachstum wurden in orthotopen Xenotransplantatmodellen von GBM unter Verwendung von TS13-64 bewertet. Die Magnetresonanztomographie (MRT) zeigte, dass die Tumoren in der Kontrollgruppe größer waren als die in der mit DFS vorbehandelten Gruppe, was darauf hindeutet, dass die Vorbehandlung mit DFS die Fähigkeit von GBM-TS verringerte, das Tumorwachstum in einem orthotopischen Maus-Xenotransplantatmodell zu fördern (Abb. 5A, B). Die Kaplan-Meier-Überlebensanalyse zeigte, dass die DFS-Vorbehandlung das Überleben der Mäuse im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant verlängerte (p = 0,0018) (Abb. 5C). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse deutlich, dass DFS die Tumorentstehungskapazität von TS13-64 reduzieren konnte.

Therapeutische Wirkungen von DFS in orthotopischen Xenotransplantatmodellen. (A,B) Tumorvolumina orthotopischer Xenotransplantatmodelle, gemessen durch Magnetresonanztomographie (MRT). (C) Kaplan-Meier-Analyse der Überlebenswahrscheinlichkeit jeder Gruppe von Mäusen, mit Vergleichen durch Log-Rank-Tests (P < 0,05) mit Bonferroni-Anpassung. (D,E) Um eindringende Zellen zu identifizieren, wurden Abschnitte des Gehirns getöteter Mäuse auf Zeb1 immungefärbt. Aus 10 Fotos, die für jede Maus aufgenommen wurden, wurde die Anzahl der infiltrierenden Zeb+-Zellen (außerhalb der roten Linie in (D)) für jede Gruppe gezählt (Mittelwert ± SEM; *P < 0,01 im Vergleich zur Kontrolle). (F) Schematische Zusammenfassung der Studie.

Darüber hinaus wurde eine Immunhistochemie (IHC) an Gehirngewebe von Mäusen durchgeführt, das auf Stammzellen und Invasivität von GBM-TSs getestet wurde, um festzustellen, wie sich DFS auf lokale Mikroumgebungszellen auswirkt (Abb. 5D). Bei mit DFS behandelten TS war die Expression von Nestin, dem Marker für Stammzellen, herunterreguliert und die Tumorränder waren ruhiger als in der mit TS behandelten Gruppe. Die Menge an Zeb1-positiven Zellen, die auf eindringende Zellen hinweisen, wurde durch DFS auch außerhalb der Gesamttumormasse reduziert (Abb. 5E).

GBM ist der häufigste und bösartigste primäre Hirntumor bei Erwachsenen mit einer ungünstigen Prognose3. Es weist bösartige Progression, Resistenz gegenüber konventioneller Behandlung und infiltrative Merkmale7 auf. Derzeit werden zahlreiche aktive Forschungen zum Ursprung von GBM aus neuralen Stammzellen in der subventrikulären Zone des erwachsenen menschlichen Gehirns und zu seinen Behandlungsmethoden durchgeführt4. Obwohl eine multimodale Therapiestrategie einschließlich Operation, Chemotherapie und Strahlentherapie vorgeschlagen wurde, ist die Gesamtüberlebensrate von Patienten mit GBM mit 14,6 bis 21,12 immer noch sehr niedrig. Ziel dieser Studie war es, eine neue Behandlungsmethode für diese anspruchsvolle Krankheit zu finden.

DFS, ein Lignan, das aus einem Methanolextrakt von A. japonica-Stämmen isoliert wurde24. A. japonica ist eine Pflanze, die in Ostasien sowohl als Nahrungsmittel als auch als Heilpflanze weit verbreitet ist19,24. Es ist bei verschiedenen Erkrankungen wie Fieber, Durchfall und Blutungen wirksam, da es verschiedene pharmakologisch aktive Komponenten enthält., In einer früheren Studie störte DFS β-Catenin-vermittelte Gene durch lysosomal-abhängigen Abbau des FOXM1-Proteins bei Dickdarmkrebs19. Es gibt jedoch keine Studie darüber, ob DFS bei GBM wirksam ist. In der vorliegenden Studie wurde die Hypothese aufgestellt, dass DFS eine proliferationshemmende Wirkung bei GBM ausüben würde, da Stammzellen und Tumorentstehung durch FOXM1/β-Catenin-Wechselwirkungen in Gliomstammzellen reguliert werden18.

Einer früheren Studie zufolge handelt es sich bei GBM TS um einen prominenten Phänotyp mit Merkmalen wie Stammhaftigkeit und Invasivität, und es wurde festgestellt, dass er für die klinische Anwendung von Wert ist6. In dieser Studie wurden GBM-Zellen aus einer Probe eines mit GBM diagnostizierten Patienten isoliert und anschließend TS durch Zellkultur gewonnen. Unter den in diesem Experiment verwendeten GBM-TS wurden die Ergebnisse für zwei GBM-TS mit der Bezeichnung TS15-88 und TS13-64 analysiert, die nach der DFS-Behandlung eine deutliche Reaktion zeigten. Es kann davon ausgegangen werden, dass GBM TS selbst die gleiche Behandlungsreaktion zeigt wie im GBM-Gewebe des Patienten und hat den Vorteil, dass es für die Anwendung von Manipulationen für In-vivo-Experimente durch Implantation in ein Mausmodell geeignet ist.

Der Wnt/β-Catenin-Signalweg wird während der Entwicklung und des Fortschreitens verschiedener Krebsarten beim Menschen abnormal aktiviert. Dieser Signalweg spielt eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung und dem Fortschreiten maligner astrozytärer Gliome25,26,27,28, unter anderem bei der Förderung von Stammzellgenen29,30,31,32, bei der Tumormigration und -invasion sowie beim Übergang vom Epithel zum Mesenchym Übergang (EMT)33,34,35. FOXM1, ein wichtiger Mediator des Wnt/β-Catenin-Signalwegs, wird bei vielen menschlichen Krebsarten, einschließlich Gliomen, überexprimiert. Der Befund der vorliegenden Studie, dass der Spiegel an FOXM1-mRNA in GBM signifikant höher war als in normalem Hirngewebe, legt nahe, dass die gezielte Behandlung von FOXM1 in GBM das Fortschreiten des Tumors unterdrücken kann. Und dieses Ergebnis legt die Möglichkeit nahe, dass DFS auch eine therapeutische Wirkung auf GBM haben könnte, wenn man den Mechanismus berücksichtigt, dass DFS durch seine Wirkung auf FOXM1 krebshemmende Wirkungen ausübt.

Es wurde gezeigt, dass die Wechselwirkung zwischen FOXM1 und β-Catenin die nukleare Translokation von β-Catenin fördert und die Expression von β-Catenin-Zielgenen erhöht, wodurch die Selbsterneuerung und Tumorentstehung von GBM-initiierenden Zellen (GICs) gefördert wird18. Die vorliegende Studie ergab, dass DFS die Wechselwirkungen zwischen FOXM1 und β-Catenin im Zellkern reduzierte und anschließend die Expression von Proteinen wie Cyclin D1 und cMyc reduzierte, indem es die Bildung des Komplexes mit TCF419,24 unterdrückte. Darüber hinaus wurden die Expressionsniveaus von mRNA, die mit dem Wnt-Signalweg und der Aktivierung von Genen im Zusammenhang mit dem β-Catenin/TCF-Komplex assoziiert sind, in DFS-behandelten GBM-TSs herunterreguliert. Die Tatsache, dass DFS die FOXM1/β-Catenin-Wechselwirkung inhibierte und anschließend die Expression von β-Catenin/TCF-Komplex-bezogenen Genen in GBM-TSs unterdrückte, legt nahe, dass DFS als Konsequenz TCF auf Transkriptionsebene regulieren kann. Es ist bekannt, dass FOXM1 die Transkription durch die direkte Bindung kleiner Moleküle wie FDI-6 reguliert. Und es wird angenommen, dass der DFS-induzierte FOXM1-Proteinabbau vom Lysosom19 abhängt. Wir haben bestätigt, dass DFS den Anreicherungsscore von FOXM1 für onkogene Transkriptionsfaktoren signifikant reduziert hat, was zeigt, dass die Expression von Zielgenen von FOXM1 insgesamt reduziert war, wie in Abb. 4A gezeigt.

Früheren Studien zufolge besteht eine starke Korrelation zwischen nuklearem β-Catenin und TCF, einem DNA-bindenden Transkriptionsfaktor18,19. In dieser Studie untersuchten wir den Anteil von β-Catenin sowohl im Zytosol als auch im Zellkern, um die subzelluläre Lokalisierung von β-Catenin quantitativ zu bestätigen (Abb. 3E). Als Ergebnis bestätigten wir, dass die Expression von aktivem β-Catenin im Zellkern verringert war. Darüber hinaus wurde bestätigt, dass die FOXM1/β-Catenin-Bindung, ein Faktor, der die Downstream-Signalübertragung von Wnt und die Transkriptionsfunktion von β-Catenin reguliert, durch DFS geschwächt wurde und folglich β-Catenin im Zellkern reduzierte.

Die vorliegende Studie untersuchte die Wirkmechanismen von DFS in GBM-TS über die FOXM1/β-Catenin-Signalwege. Es wurde festgestellt, dass die Hemmung von FOXM1 die Zellproliferation reduziert und Apoptose induziert36,37, wohingegen eine Überexpression von FOXM1 das Fortschreiten des Zellzyklus38,39 und die Zellproliferation durch direkte Aktivierung der Transkription von Genen fördert, die für Cyclin D1 und Cyclin B140,41 kodieren. Die vorliegende Studie ergab, dass DFS die Lebensfähigkeit von GBM-TSs hemmte und die Anzahl der Zellen in der Sub-G1-Phase des Zellzyklus signifikant erhöhte, was darauf hindeutet, dass die DFS-Zytotoxizität durch Apoptose vermittelt wird. Darüber hinaus verringerte DFS die Proteinexpression von Bcl-2 und erhöhte die Expression von gespaltener Caspase-3 und BAX. Die Analyse von DEGs zeigte, dass DFS Gene hochregulierte, die an den Sub-G1-, S- und G2-Phasenübergängen des Zellzyklus beteiligt waren. Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass DFS durch die Induktion von Zellzyklusstopp und Apoptose ein Antikrebspotenzial in menschlichen GBM-Zellen besitzt.

Es wurde gezeigt, dass FOXM1 die Stammzellenfunktion von GBMs fördert, indem es den Hauptstammzellregulator SOX242 reguliert. Darüber hinaus fördert FOXM1 die EMT und ist maßgeblich an der Entstehung eines Krebsstammzell-Phänotyps (CSC) in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen beteiligt. Die vorliegende Studie untersuchte die herausragenden Phänotypen von GBM-TS, die Stammhaftigkeit und Invasivität aufweisen. Es ist bekannt, dass stammähnliche Zellen, die GBM-TS in Tumoren induzieren, die Behandlungsresistenz und das Wiederauftreten beeinflussen, was die Hemmung von Stammzellen und Invasivität zu einem positiven Indikator für die Bewertung der potenziellen Wirksamkeit von DFS macht.

Für alle anderen Experimente verwendeten wir zwei TSs, TS13-64 und TS15-88, mit Ausnahme des In-vivo-Mausmodells, das nur mit TS13-64 durchgeführt wurde, da zwischen diesen beiden TSs kein signifikanter Unterschied in der Wirkung von DFS bestand. Und TS13-64 hatte im Vergleich zu TS15-88 eine kürzere Mausüberlebenszeit und es standen insgesamt mehr Versuchsdaten zur Verfügung. Darüber hinaus wurden In-vivo-Experimente mit einem orthotopen Xenotransplantat-Mausmodell leider nur als Vorbehandlungsmethode durchgeführt, nicht mit anderen Methoden wie intravenöser, intraperitonealer oder lokaler Injektion. Wir haben zuvor ein Experiment zur Verabreichung von DFS an Mäuse durch intraperitoneale Injektion durchgeführt, die Wirkung von DFS aus dem Experiment war jedoch nicht erkennbar. Da es sich bei DFS außerdem um ein neues Medikament handelt, das sich noch im Forschungsstadium befindet, ist der Wirkungsmechanismus im Gehirn noch nicht geklärt. Deshalb führten wir unter Bezugnahme auf andere Literatur48,49 ein Experiment mit der Vorbehandlungstechnik durch. Um diese Einschränkung zu überwinden, sollten in der nächsten Phase der DFS-Studie Untersuchungen zu anderen Injektionsmethoden als der Vorbehandlung durchgeführt werden, die den Einsatz dieses Arzneimittels erhöhen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass DFS durch Unterdrückung von FOXM1 die Signalschritte von Stammzellen, Invasivität und Proliferation beeinträchtigen kann (Abb. 5F). DFS hemmte folglich die Proliferation von GBM-TSs in vivo und verlängerte die Überlebenszeit von Mäusen mit orthotopen GBM-Xenotransplantaten. Diese Ergebnisse wurden aus von GBM-Patienten stammenden Zellen und einem entsprechenden Mausmodell erhalten und unterstreichen die klinische Anwendbarkeit von DFS als neue Behandlung für GBM. DFS könnte ein potenzielles therapeutisches Mittel sein, um das Fortschreiten des GBM zu hemmen, indem es die Apoptose erhöht und die Lebensfähigkeit, Stammzellenzahl und Invasivität der Zellen bei Patienten mit refraktärem GBM verringert. Diese Studie ist insofern aussagekräftig, als es die erste Studie ist, die bestätigt, ob DFS auch bei GBM eine krebshemmende Wirkung zeigt, basierend auf der Tatsache, dass es bei Darmkrebs eine hemmende Wirkung zeigt. Es gibt viele Studien, die sich mit der medizinischen Behandlung von GBM befassen, aber es gibt nur wenige Studien, die auf andere als die derzeit verwendeten Therapeutika hinweisen. Hierbei handelt es sich um eine Studie, die die Möglichkeit bestätigt, dass DFS zusätzlich zu Medikamenten wie Temozolomid und Bevacizumab als weitere Option zur medizinischen Behandlung von GBM eingesetzt werden könnte. Zukünftig sollten Folgestudien durchgeführt werden, um zu bestätigen, ob DFS für den klinischen Einsatz zur Behandlung von Patienten mit GBM geeignet ist. Es wird erwartet, dass DFS ein Schlüsselmaterial sein wird, das der Eroberung des GBM einen Schritt näher kommen kann.

GBM-TSs wurden von zwei einzelnen Patienten mit GBM abgeleitet. Diese GBM-TS mit der Bezeichnung TS15-88 und TS13-64 wurden aus frischen GBM-Gewebeproben ermittelt, wie vom institutionellen Prüfungsausschuss des Yonsei University College of Medicine genehmigt. TSs wurden nach Standardmethoden 44,45,46 kultiviert. Kurz gesagt, die Zellen wurden in TS-Komplettmedium kultiviert, bestehend aus Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium/F12 (Mediatech, Manassas, VA, USA), 1 × B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 20 ng/ml basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor ( bFGF; Novoprotein, Summit, NJ, USA) und 20 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF; Novoprotein). Alle In-vitro-Experimente wurden unter den Kulturbedingungen für TS durchgeführt. DFS, ein Anti-GBM-Lignan, wurde wie beschrieben aus einer Chloroform-löslichen Fraktion von A. japonica-Extrakten isoliert19.

Lysate von GBM-TS wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) auf Tris-Glycin-Gelen aufgetrennt. Zytosolische und nukleare Fraktionen wurden unter Verwendung von zytoplasmatischen bzw. nuklearen Extraktionsreagenzien (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Proteine wurden auf Nitrozellulosemembranen übertragen und mit Antikörpern gegen gespaltene Capase-3, CD133, PDPN, β-Catenin, aktives β-Catenin, CD44, Schnecke, Cyclin D1 und cMYC (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) untersucht; Sox2 (Merck Millipore, Darmstadt, Deutschland); Msi-1 (Abcam, Cambridge, Großbritannien); Nestin (Novus Biologicals, Centennial, CO, USA); N-Cadherin, Zeb1 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA); Twist, 3./4. Okt., BAX, Bcl-2, PARP und GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA); und FOXM1 (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA), zusammen mit Western Lightning Plus-verstärktem Chemilumineszenzreagenz (PerkinElmer, Lawrence, MA, USA). Die Bilder wurden mit einem ImageQuant LAS 4000 mini (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK) aufgenommen. Wir haben alle Ergebnisse des Western-Blots als Geigendiagramm ausgedrückt und dies als Ergänzung 5 hinzugefügt. Das Originalbild des Blots in voller Länge wurde als Ergänzung 6 hinzugefügt.

Um die Wechselwirkungen zwischen FOXM1 und β-Catenin zu bestimmen, wurden GBM-TSs 72 Stunden lang mit DFS behandelt, mit Lysepuffer lysiert und mit Anti-FOXM1- oder Anti-β-Catenin-Antikörper auf einem Rotator über Nacht bei 4 °C inkubiert. Protein-Antikörper-Protein-A/G-Agarose-Komplexe wurden unter Verwendung von Protein-A/G-Sepharose-Kügelchen (Santa Cruz Biotechnology) für 4 Stunden bei 4 °C hergestellt. Nach ausgiebigem Waschen mit PBST wurden die immunpräzipitierten Komplexe mit 0,1 M Glycin-HCl (pH 2,7) eluiert und mit neutralisierendem Puffer (1 M Tris-HCl, pH 9,0) neutralisiert. Die Niederschläge wurden dann mit SDS-Probenpuffer resuspendiert und 10 Minuten lang gekocht. Die ausgefällten Proteine wurden einem Immunoblot mit den angegebenen Antikörpern unterzogen.

GST-markiertes β-Catenin wurde im E. coli-Stamm DH5α exprimiert und durch Affinitätschromatographie an Glutathion-Sepharose 4B-Kügelchen (GE Healthcare) gereinigt. Mit der Flagge markiertes FOXM1 wurde durch Transfektion gemäß Herstellerempfehlung in TS15-88 bzw. TS13-64 durch Lysat hergestellt. Die Bestätigung der Reinheit der rekombinanten Proteine erfolgte mittels Coomassie-Brillantblau-Färbung durch Geltrennung. Für den GST-Pulldown-Assay wurden gereinigtes rekombinantes GST-β-Catenin und GST-Kontrollprotein mit 20 μl 50 %iger Glutathion-Agarose-Kügelchenaufschlämmung (GE Healthcare) in Bindungspuffer etwa 1 Stunde lang bei 4 °C co-inkubiert. Der Perlenelutionsprozess wurde nach dreimaligem Waschen der Perlen mit einem Bindungspuffer durchgeführt. Anschließend wurde die Erhitzung des SDS-Probenpuffers beurteilt und ein Immunblotting mit Anti-Flag-Antikörper durchgeführt.

Die kanonische TCF/LEF-Signalaktivität wurde mithilfe von TOPflash/FOPflash-Reporter-Assays gemessen. Kurz gesagt, 1 × 105 Zellen wurden vor der Transfektion einen Tag lang in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen ausgesät. Die Zellen wurden mit 100 ng Glühwürmchen-Luciferase-Reporterplasmid und 10 ng internem Kontrollplasmid pRL-TK (Promega, Madison, WI, USA) unter Verwendung von Lipofectamine 3000 (Invitrogen) 72 Stunden lang gemäß dem Protokoll des Herstellers transfiziert. Die Proben wurden mit 1 × Reporter-Lysepuffer 15 Minuten lang lysiert und zentrifugiert, und die Überstände wurden gemäß den Protokollen des Herstellers für Luciferase- und β-Galactosidase-Assays verwendet. Nachdem mithilfe von β-Galactosidase-Assays bestätigt wurde, dass die Zellen transfiziert worden waren, wurde die Luciferase-Aktivität in 10 μg Proteinlysat mithilfe des Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega) quantifiziert. Jede Probe wurde dreifach analysiert.

Die Auswirkungen von DFS auf das Überleben von GBM-TS wurden mithilfe von WST-Assays (Promega) bestimmt. Kurz gesagt, 1 × 104 einzelne dissoziierte GBM-TS wurden in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen ausgesät. Die Platten wurden 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und 72 Stunden lang mit DFS behandelt. WST-Reagenz (10 μl/Well) wurde zugegeben und die Absorption bei 450 nm nach einstündiger Inkubation bei 37 °C gemessen. Jedes Experiment wurde dreimal in dreifacher Ausfertigung wiederholt und die Ergebnisse werden als Prozentsatz lebensfähiger Zellen im Vergleich zu Kontrollen ausgedrückt.

Dispergierte GBM-TS wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen pro Well ausplattiert. Nach 24-stündiger Inkubation wurden die TS drei Tage lang mit DFS behandelt und anschließend die ATP-Spiegel mit dem CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) gemäß dem Protokoll des Herstellers verglichen. Kurz gesagt wurde in jede Vertiefung ein Volumen CellTiter-Glo-Reagenz gegeben, das dem Volumen des Zellkulturmediums entsprach. Anschließend wurden die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und die Lumineszenz gemessen.

Zur Analyse des Zellzyklus wurden GBM-TSs, die 72 Stunden lang mit DFS behandelt wurden, gesammelt, mit 70 % Ethanol fixiert, mit Accutase (Sigma) dissoziiert und mit 100 µg/ml Propidiumiodid (PI, Sigma) bei 4 °C gefärbt 15 Minuten im Dunkeln. Um die DFS-induzierte Apoptose in GBM-TS zu bewerten, wurden GBM-TS mit der angegebenen DFS-Konzentration behandelt. Der apoptotische Zelltod wurde durch Doppelfärbung mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugiertem Annexin V (BioLegend, San Diego, CA, USA) und PI nachgewiesen. Die gefärbten Zellen wurden mit einem LSR II-Durchflusszytometer (BD Biosciences, Bedford MA, USA) analysiert.

Zehn einzelne dissoziierte GBM-TS wurden in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen ausgesät und nach 24 Stunden mit DFS behandelt. Die Platten wurden 3 Wochen lang in TS-Komplettmedium inkubiert, wobei das Medium jede Woche gewechselt wurde. Die Anzahl der kugelpositiven Vertiefungen wurde gezählt und das Verhältnis der kugelpositiven Vertiefungen in der behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe berechnet. Der Radius der Kugeln in jeder Gruppe wurde ebenfalls gemessen. Die Bilder wurden mit der ToupView-Software (ToupTek Photonics, Zhejiang, China) aufgenommen und analysiert.

Jede Vertiefung einer 96-Well-Platte wurde mit einer gemischten Matrix aus Matrigel (Corning Incorporated, Tewsbury, MA, USA), Kollagen Typ I (Corning Incorporated) und TS-Komplettmedium gefüllt. Vor der Gelierung wurden einzelne Sphäroide in die Matrix eingesät, gefolgt von der Zugabe von TS-Komplettmedium über die gelierte Matrix, um ein Austrocknen zu verhindern. Das eingedrungene Gebiet wurde als besetztes Gebiet bei (72 h − 0 h)/0 h quantifiziert.

GBM-TSs wurden inkubiert, indem sie an Deckgläsern in 24-Well-Platten befestigt wurden. Nach 48-stündiger Behandlung mit oder ohne Behandlung wurden die Zellen 10 Minuten lang mit 3,8 % Formaldehyd fixiert. Der Permeabilisierungsprozess wurde mit 0,1 % NP40/PBS durchgeführt und mit 1 % BSA/PBS für 1 Stunde blockiert. Um gleichzeitig die subzelluläre Lokalisierung von β-Catenin und FOXM1 zu beobachten, wurden β-Catenin (1:1000) und FOXM1 (1:1000) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit einem sekundären Antikörper, der mit Alexa Fluor 488, 546 (1:1000) konjugiert war, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit einer DAPI-haltigen Montagelösung (Vetcached H-1200) montiert und mit einem konfokalen Mikroskop (LSM700; Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) abgebildet. Die erfassten Zellbilder wurden mit der Software ZEN 2009 analysiert. Die ImageJ-Software wurde verwendet, um die relative Fluoreszenzintensität von FOXM1 und β-Catenin zu berechnen.

Die Gesamt-RNA wurde aus GBM-TSs extrahiert und für die RNA-Sequenzierung verwendet. Die Qualität der Lesevorgänge wurde mit FastQC (v.0.10.1) überprüft und die Sequenzierungsadapter wurden mit Trimmomatic (v. 0.38) entfernt. Lesevorgänge mit geringer Qualität wurden nach den folgenden Kriterien gefiltert: Lesevorgänge, die mehr als 10 % der übersprungenen Basen enthielten (markiert als „N“), Lesevorgänge, die mehr als 40 % der Basen mit Qualitätswerten unter 20 enthielten, und Lesevorgänge, deren durchschnittliche Qualitätswerte jeweils unter 20 lagen Die Anzahl der Lesevorgänge betrug weniger als 20. Gefilterte Lesevorgänge wurden mithilfe des Aligners Tophat47 auf das menschliche Referenzgenom abgebildet. Die Genexpressionsniveaus wurden mit Cufflinks v2.1.148 unter Verwendung der Genannotationsdatenbank der Ensembl-Version 7249 gemessen. Nicht-kodierende Regionen wurden mit der Option –mask entfernt. Mithilfe der GENE-E-Software wurde die durchschnittliche Verknüpfung der hierarchischen Clusterbildung mit der Pearson-Korrektur als Distanzmetrik und den als Heatmaps dargestellten Ausdrucksniveaus ermittelt.

Männliche athymische Nacktmäuse im Alter von 4 bis 8 Wochen (Central Lab. Animal Inc., Seoul, Korea) wurden unter sterilen Bedingungen in Mikroisolatorkäfigen gehalten und vor Beginn der Studie mindestens eine Woche lang überwacht, um eine ordnungsgemäße Gesundheit sicherzustellen. Beleuchtung, Temperatur und Luftfeuchtigkeit wurden zentral gesteuert. Dissoziierte Luc-TS13-64-Zellen wurden 72 Stunden lang mit 10 µM DFS unter Verwendung des Vorbehandlungsprotokolls50,51 vorbehandelt. Die Zellen wurden durch Trypanblau-Färbung ausgewählt und 5 × 105 lebensfähige Zellen wurden mithilfe eines Führungsschraubensystems in einer Tiefe von 4,5 mm in den rechten Frontallappen jeder Maus implantiert44,45,46,52. Mäuse, die eine Verringerung des Körpergewichts um > 15 % im Vergleich zum Maximum aufwiesen, wurden gemäß dem genehmigten Protokoll eingeschläfert. Für die Immunhistochemie wurden mit einem Mikrotom 4 μm dicke Schnitte gewonnen und auf Klebeobjektträger übertragen. Die Antigengewinnung und die Antikörperanlagerung wurden mit einem automatisierten Instrument (Discovery XT, Ventana Medical Systems) durchgeführt. Nestin und Zeb1 wurden mithilfe eines Peroxidase/3,3ʹ-Diaminobenzidin-Färbesystems nachgewiesen.

Die Signifikanzniveaus für Vergleiche zwischen Behandlungsgruppen wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test für mehrere Vergleiche bestimmt. Das Überleben wurde mit der Kaplan-Meier-Methode analysiert und durch Log-Rank-Tests verglichen. Alle Grafiken und statistischen Analysen wurden mit der Software GraphPad Prism 9 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) durchgeführt, wobei P-Werte < 0,05 als statistisch signifikant angesehen wurden.

Alle Patienten gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab, und die Genehmigung zur Probenentnahme und -auswertung wurde von den Institutional Review Boards unserer Institute eingeholt (Nr. 4-2021-1319). Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und ethischen Vorschriften des institutionellen und nationalen Forschungsausschusses durchgeführt.

Alle geltenden internationalen, nationalen und/oder institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren wurden befolgt. Alle Verfahren mit Tieren folgten den ethischen Standards der Institution oder Praxis, in der die Studien durchgeführt wurden. Alle Verfahren im Zusammenhang mit den In-vivo-Experimenten und der Tierpflege wurden vom Ausschuss für die Pflege und Verwendung von Labortieren am Yonsei University College of Medicine (Nr. 2020-0248) genehmigt und gemäß den Richtlinien der Pflege und Verwendung von durchgeführt Labortiere, veröffentlicht von den US National Institutes of Health. Für die Berichterstattung über Tierversuche, die in der vorliegenden Studie durchgeführt wurden, haben wir uns an die ARRIVE-Richtlinie gehalten.

Dieser Artikel enthält keine von einem der Autoren durchgeführten Studien mit menschlichen Teilnehmern.

Die hier beschriebene Arbeit wurde noch nie veröffentlicht und wird nicht für eine anderweitige Veröffentlichung in Betracht gezogen. Alle Autoren haben das Manuskript genehmigt.

Die im Rahmen der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind aufgrund des Risikos einer Beeinträchtigung der Privatsphäre des Einzelnen nicht öffentlich zugänglich, können jedoch auf begründete Anfrage und mit einer angemessen vereinbarten Zusammenarbeit beim jeweiligen Autor angefordert werden.

Hoshide, R. & Jandial, R. 2016: Klassifikation von Tumoren des Zentralnervensystems durch die Weltgesundheitsorganisation: Eine Ära der Molekularbiologie. Weltneurochirurg. 94, 561–562. https://doi.org/10.1016/j.wneu.2016.07.082 (2016).

Artikel PubMed Google Scholar

Stupp, R. et al. Auswirkungen einer Strahlentherapie mit begleitendem und adjuvantem Temozolomid im Vergleich zu einer Strahlentherapie allein auf das Überleben bei Glioblastomen in einer randomisierten Phase-III-Studie: 5-Jahres-Analyse der EORTC-NCIC-Studie. Lancet Oncol. 10, 459–466. https://doi.org/10.1016/S1470-2045(09)70025-7 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Roh, TH, Park, HH & Kang, SG Langzeitergebnisse der gleichzeitigen Radiochemotherapie mit Temozolomid bei neu diagnostizierten Glioblastompatienten: Eine Single-Center-Analyse (Bd. 96, e7422, 2017). Medizin 96, e7422. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000007422 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, JH et al. Das menschliche Glioblastom entsteht aus Zellen der subventrikulären Zone mit Treibermutationen auf niedrigem Niveau. Natur 560, 243–247. https://doi.org/10.1038/s41586-018-0389-3 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Yoon, SJ et al. Zellulären Ursprungs von Glioblastomen und das Feuerwerksmuster der Krebsentstehung aus der subventrikulären Zone. J. Koreanischer Neurochirurg. Soc. 63, 26–33. https://doi.org/10.3340/jkns.2019.0129 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kang, SG et al. Potenzielle Verwendung der Glioblastom-Tumorsphäre: Klinische Zertifizierung. Bogen. Pharm. Res. 38, 402–407. https://doi.org/10.1007/s12272-015-0564-0 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Auffinger, B., Spencer, D., Pytel, P., Ahmed, AU & Lesniak, MS Die Rolle von Gliomstammzellen bei der Chemotherapieresistenz und dem Wiederauftreten von Glioblastoma multiforme. Experte Rev. Neurother. 15, 741–752. https://doi.org/10.1586/14737175.2015.1051968 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kalin, TV, Ustiyan, V. & Kalinichenko, VV Mehrere Gesichter des FoxM1-Transkriptionsfaktors, Lehren aus transgenen Mausmodellen. Zellzyklus 10, 396–405. https://doi.org/10.4161/cc.10.3.14709 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Anders, L. et al. Ein systematisches Screening auf CDK4/6-Substrate verknüpft die FOXM1-Phosphorylierung mit der Unterdrückung der Seneszenz in Krebszellen. Krebszelle 20, 620–634. https://doi.org/10.1016/j.ccr.2011.10.001 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kong, XY et al. Eine fehlregulierte Expression von FOXM1-Isoformen treibt das Fortschreiten von Bauchspeicheldrüsenkrebs voran. Krebs Res. 73, 3987–3996. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-12-3859 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, DW et al. Die entscheidende Rolle der fehlregulierten FOXM1-PLAUR-Signalübertragung bei der Progression und Metastasierung von Dickdarmkrebs beim Menschen. J. Clin. Onkol. 19, 62–72. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-12-1588 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Priller, M. et al. Die Expression von FoxM1 ist für die Proliferation von Medulloblastomzellen erforderlich und weist auf ein schlechteres Überleben der Patienten hin. Klin. Krebs Res. 17, 6791–6801. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-11-1214 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, ZW et al. Forkhead-Box-M1-Transkriptionsfaktor: Ein neuartiges Ziel für die Krebstherapie. Krebs behandeln. Rev. 36, 151–156. https://doi.org/10.1016/j.ctrv.2009.11.006 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dai, B. et al. Eine fehlerhafte FoxM1B-Expression erhöht die Transkription der Matrix-Metalloproteinase-2 und verstärkt die Invasion von Gliomzellen. Oncogene 26, 6212–6219. https://doi.org/10.1038/sj.onc.1210443 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dai, BB et al. FoxM1B reguliert die NEDD4-1-Expression und führt zu einer Zelltransformation und einem vollständigen malignen Phänotyp in immortalisierten menschlichen Astrozyten. Krebs Res. 70, 2951–2961. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-09-3909 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, YJ et al. FoxM1B reguliert transkriptionell die Expression des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors und fördert die Angiogenese und das Wachstum von Gliomzellen. Krebs Res. 68, 8733–8742. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-08-1968 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koo, CY, Muir, KW & Lam, EWF FOXM1: Von der Krebsentstehung bis zum Fortschreiten und der Behandlung. Bba-Gen-Regul. Mech. 1819, 28–37. https://doi.org/10.1016/j.bbagrm.2011.09.004 (1819).

Artikel CAS Google Scholar

Zhang, N. et al. FoxM1 fördert die Kernlokalisierung von Beta-Catenin und kontrolliert die Wnt-Zielgenexpression und die Gliomtumorentstehung. Krebszelle 20, 427–442. https://doi.org/10.1016/j.ccr.2011.08.016 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dong, GZ et al. Ein Lignan induziert den lysosomal abhängigen Abbau des FoxM1-Proteins, um die nukleare Translokation von Beta-Catenin zu unterdrücken. Wissenschaft. Rep. 7, 1–10. https://doi.org/10.1038/srep45951 (2017).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Kwon, J., Lee, Y., Jeong, JH, Ryu, JH & Kim, KI Die Hemmung der Autophagie sensibilisiert den durch Lignan induzierten stressbedingten Zelltod des endoplasmatischen Retikulums. Biochem. Biophys. Res. Komm. 526, 300–305. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2020.03.081 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liu, HW et al. Die Störung der Beta-Catenin/TCF-1/STAT3-Signalachse durch 4-Acetylantrochinonol b hemmt die Tumorentstehung und die krebsstammzellähnlichen Eigenschaften von Glioblastomzellen in vitro und in vivo. Cancers (Basel) 10, 491. https://doi.org/10.3390/cancers10120491 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Liu, M. et al. FoxM1B wird in menschlichen Glioblastomen überexprimiert und reguliert entscheidend die Tumorigenität von Gliomzellen. Krebs Res. 66, 3593–3602. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-05-2912 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Garcia-Alonso, L., Holland, CH, Ibrahim, MM, Turei, D. & Saez-Rodriguez, J. Benchmark und Integration von Ressourcen für die Schätzung menschlicher Transkriptionsfaktoraktivitäten (Bd. 29, S. 1363, 2019). Genomres. 31, 745–745 (2021).

Artikel Google Scholar

Lee, H., Jeong, JH & Ryu, JH Lignan aus Alnus japonica hemmt die Adipozytendifferenzierung über den Zellzyklus und die FOXO1-Regulation. Molecules 25, 3346. https://doi.org/10.3390/molecules25153346 (2020).

Artikel CAS PubMed Central Google Scholar

Utsuki, S. et al. Zusammenhang zwischen der Expression von E-, N-Cadherinen und Beta-Catenin und dem Tumorgrad bei Astrozytomen. J. Neuro-Oncol. 57, 187–192. https://doi.org/10.1023/a:1015720220602 (2002).

Artikel Google Scholar

Schule, R. et al. Mögliche kanonische Aktivierung des Wnt-Signalwegs bei hochgradigen Astrozytomen. Wissenschaft. Welt J. https://doi.org/10.1100/2012/697313 (2012).

Artikel Google Scholar

Yang, CZ et al. Die Beta-Catenin-Signalübertragung initiiert die Aktivierung von Astrozyten und ihre Fehlregulation trägt zur Pathogenese von Astrozytomen bei. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 109, 6963–6968. https://doi.org/10.1073/pnas.1118754109 (2012).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, XR et al. Beta-Catenin-Überexpression bei malignen Gliomen und ihre Rolle bei der Proliferation und Apoptose in Glioblastmazellen. Med. Onkol. 28, 608–614. https://doi.org/10.1007/s12032-010-9476-5 (2011).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Lan, FM, Pan, Q., Yu, HM & Yue, J. Neurochem. 134, 811–818. https://doi.org/10.1111/jnc.13174 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zheng, HW et al. PLAGL2 reguliert die Wnt-Signalübertragung, um die Differenzierung in neuralen Stammzellen und Gliomen zu behindern. Krebszelle 17, 497–509. https://doi.org/10.1016/j.ccr.2010.03.020 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shi, L., Fei, In-vitro-Zellentwicklung. Anim. 51, 1047–1055. https://doi.org/10.1007/s11626-015-9931-x (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Rheinbay, E. et al. Ein abnormales Transkriptionsfaktornetzwerk, das für die Wnt-Signalisierung und die Stammzellerhaltung beim Glioblastom essentiell ist. Cell Rep. 3, 1567–1579. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2013.04.021 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, KH et al. Die Wnt/Beta-Catenin-Signalübertragung ist ein wichtiger nachgeschalteter Mediator der MET-Signalübertragung in Glioblastom-Stammzellen. Neuro Oncol. 15, 161–171. https://doi.org/10.1093/neuonc/nos299 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Holland, JD, Klaus, A., Garratt, AN & Birchmeier, W. Wnt-Signalisierung in Stamm- und Krebsstammzellen. Curr. Meinung. Zellbiol. 25, 254–264. https://doi.org/10.1016/j.ceb.2013.01.004 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kahlert, UD et al. Die Aktivierung der kanonischen WNT/Beta-Catenin-Signalübertragung steigert die In-vitro-Motilität von Glioblastomzellen durch Aktivierung von ZEB1 und anderen Aktivatoren des Übergangs vom Epithel zum Mesenchym. Krebs Lett. 325, 42–53. https://doi.org/10.1016/j.canlet.2012.05.024 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bhat, UG, Halasi, M. & Gartel, AL Thiazol-Antibiotika zielen auf FoxM1 ab und induzieren Apoptose in menschlichen Krebszellen. PLoS One 4, e5592. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005592 (2009).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shi, M., Cui, JJ & Xie, KP Signalisierung von MiRNAs-FOXM1 bei Krebs und mögliche gezielte Therapie. Curr. Drug Targets 14, 1192–1202. https://doi.org/10.2174/13894501113149990192 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu, C. et al. Das Targeting von FoxM1 hemmt die Proliferation, Invasion und Migration von Nasopharynxkarzinomen über den Übergangsweg vom Epithel zum Mesenchym. Onkol. Rep. 33, 2402–2410. https://doi.org/10.3892/or.2015.3834 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, IC et al. Forkhead Box m1 reguliert das Transkriptionsnetzwerk von Genen, die für das Fortschreiten der Mitose essentiell sind, und von Genen, die für die Ubiquitinligase SCF (Skp2-Cks1) kodieren. Mol. Zelle. Biol. 25, 10875–10894. https://doi.org/10.1128/MCB.25.24.10875-10894.2005 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hu, C. et al. Die durch LXR alpha vermittelte Herunterregulierung von FOXM1 unterdrückt die Proliferation hepatozellulärer Karzinomzellen. Oncogene 33, 2888–2897. https://doi.org/10.1038/onc.2013.250 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, XH et al. Erhöhte Werte des Forkhead-Box-M1B-Transkriptionsfaktors in transgenen Maushepatozyten verhindern altersbedingte Proliferationsdefekte in der regenerierenden Leber. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 98, 11468–11473. https://doi.org/10.1073/pnas.201360898 (2001).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, Y. et al. FoxM1 fördert die Stammzelle und Strahlenresistenz von Glioblastomen, indem es den Master-Stammzellregulator Sox2 reguliert. PLoS One 10, e0137703. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137703 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bao, B. et al. Eine Überexpression von FoxM1 führt zu einem epithelial-mesenchymalen Übergang und einem Krebsstammzell-Phänotyp in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen (zurückgezogener Artikel. Siehe Bd. 117, S. 1963, 2016). J. Zelle. Biochem. 112, 2296–2306. https://doi.org/10.1002/jcb.23150 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Park, J. et al. Die Regulierung der Bioenergetik durch doppelte Hemmung der Aldehyddehydrogenase und des Mitochondrienkomplexes I unterdrückt Glioblastom-Tumorsphären. Neuro Oncol. 20, 954–965. https://doi.org/10.1093/neuonc/nox243 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kong, BH et al. Isolierung von Gliomkrebs-Stammzellen in Bezug auf histologische Grade in Gliomproben. Kindernerv. Syst. 29, 217–229. https://doi.org/10.1007/s00381-012-1964-9 (2013).

Artikel Google Scholar

Kwak, J. et al. Isolierung und Charakterisierung von Tumorsphären eines Patienten mit rezidivierendem Pineoblastom: Machbarkeit eines vom Patienten stammenden Xenotransplantats. Int. J. Oncol. 49, 569–578. https://doi.org/10.3892/ijo.2016.3554 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Trapnell, C., Pachter, L. & Salzberg, SL TopHat: Entdeckung von Spleißverbindungen mit RNA-Seq. Bioinformatik 25, 1105–1111. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp120 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Trapnell, C. et al. Differenzielle Gen- und Transkriptexpressionsanalyse von RNA-seq-Experimenten mit TopHat und Cufflinks. Nat. Protokoll. 7, 562–578. https://doi.org/10.1038/nprot.2012.016 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Flicek, P. et al. Ensemble 2013. Nucleic Acids Res. 41, D48–D55. https://doi.org/10.1093/nar/gks1236 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Xia, W. et al. Der Smad-Inhibitor induziert die CSC-Differenzierung für eine wirksame Chemosensibilisierung in Cyclin D1- und TGF-beta/Smad-regulierten stammzellähnlichen Leberkrebszellen. Oncotarget 8, 38811–38824. https://doi.org/10.18632/oncotarget.16402 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Couturier, CP et al. Einzelzell-RNA-Seq zeigt, dass das Glioblastom eine normale neurologische Entwicklungshierarchie rekapituliert (Bd. 11, 3406, 2020). Nat. Komm. 11, 3406. https://doi.org/10.1038/s41467-020-17186-5 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lal, S. et al. Ein implantierbares Führungsschraubensystem für Hirntumorstudien bei Kleintieren. J. Neurochirurg. 92, 326–333. https://doi.org/10.3171/jns.2000.92.2.0326 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

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Diese Studie wurde von der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt und vom Ministerium für Wissenschaft und IKT finanziert (NRF-2020M2D9A2092372); die Regierung von Korea (MSIT) (NRF-2022R1A2B5B03001199); das Bio and Medical Technology Development Program der National Research Foundation (NRF), finanziert vom Ministerium für Wissenschaft und IKT (NRF-2020M3E5E2037960); ein „Team Science Award“ des Yonsei University College of Medicine (6-2021-0192); und das Hanim Precision Medicine Center des Yonsei University Health System unter der Fördernummer (6-2021-0127) an SGK

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Jin-Kyoung Shim und Seung Hoon Lim.

Abteilung für Neurochirurgie, Hirntumorzentrum, Severance Hospital, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Republik Korea

Jin-Kyoung Shim, Seung Hoon Lim, Ran Joo Choi, Yoojung Oh, Junseong Park, Junpyo Hong, Seo Jin Kim, Ju Hyung Moon, Eui Hyun Kim, Jong Hee Chang und Seok-Gu Kang

Abteilung für Neurochirurgie, Kyung Hee University College of Medicine, Seoul, Republik Korea

Seung Hoon Lim & Bong Jin Park

Forschungsinstitut für Pharmazeutische Wissenschaften und Hochschule für Pharmazie, Sookmyung Women's University, Seoul, Republik Korea

Ji Hye Jeong, Sunghee Choi und Jae-Ha Ryu

Precision Medicine Research Center, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Republik Korea

Junseong-Park

Programm für Krebs- und Stammzellbiologie, Duke-NUS Medical School, Singapur, Singapur

Wan-Yee Teo

Institut für Molekular- und Zellbiologie, A*STAR, Singapur, Singapur

Wan-Yee Teo

Department of Medical Science, Yonsei University Graduate School, Seoul, Republik Korea

Seok-Gu Kang

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Konzeptualisierung: J.-KS, SHL und S.-GK; Methodik: J.-KS, SHL, JHJ, RJC, YO, JP, SC, JH und SJK; Formale Analyse und Untersuchung: J.-KS; Ressourcen: JHJ, SC, JHM, EHK, BJP und JHC; Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung: J.-KS und SHL; Schreiben – Rezension und Bearbeitung: J.-KS, SHL, RJC, J.-HR und S.-GK; Fördermitteleinwerbung, S.-GK Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und sind damit einverstanden.

Korrespondenz mit Jae-Ha Ryu oder Seok-Gu Kang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Shim, JK., Lim, SH, Jeong, JH et al. Ein Lignan aus Alnus japonica hemmt Glioblastom-Tumorsphären durch Unterdrückung von FOXM1. Sci Rep 12, 13990 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18185-w

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Eingegangen: 29. Dezember 2021

Angenommen: 08. August 2022

Veröffentlicht: 17. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18185-w

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Ein Lignan aus Alnus japonica hemmt Glioblastom-Tumorsphären durch Unterdrückung von FOXM1